[發(fā)明專利]一種兔皮膚真菌復(fù)合PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410204465.9
• 申請日: 2014-05-15
• 公開（公告）號: CN104004835A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉彥威;劉娜;劉利強(qiáng);杜鵑;石玉祥;張永英;王慧真
• 申請（專利權(quán)）人: 河北工程大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 石家莊元匯專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 13115
• 代理人: 劉聞鐸

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種兔皮膚真菌感染的檢測方法，具體涉及一種兔皮膚真菌復(fù)合PCR檢測方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

皮膚真菌(Dermatophyte)是皮膚真菌病的病原菌。兔皮膚真菌病(Dermatomycosis)是一類傳染性極強(qiáng)的人畜共患病，不僅危害養(yǎng)兔業(yè)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，還傳染人，影響人體健康。皮膚真菌病的病原涉及三個(gè)屬，分別為毛癬菌屬(Trichophyton)、小孢子菌屬(Microsporum)和表皮癬菌屬(Epidermophyton)。兔皮膚真菌流行病學(xué)調(diào)查顯示須癬毛癬菌、犬小孢子菌和絮狀表皮癬菌是最常見皮膚真菌。不同的皮膚真菌侵染部位不同，引起的病變有差異，用藥和采取防控措施也各不相同，因此，對皮膚病真菌種類鑒定顯得非常重要。

目前，常見皮膚真菌檢測方法包括：病料直接顯微觀察、病原分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法。病料直接顯微觀察簡單、快速，但無法鑒別真菌的種類，有5％-15％假陰性；病原分離培養(yǎng)雖然通過菌落、菌絲和孢子的形態(tài)，結(jié)合生化試驗(yàn)，可以明確真菌種類，但由于皮膚真菌生長緩慢，一般為3-4周，耗時(shí)長，且有40％假陰性；分子生物學(xué)方法包括染色體DNA?G+C的含量、總DNA同源性、線粒體DNA限制酶斷片長度多態(tài)分析、隨機(jī)引物PCR、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析、PCR指紋等。最近發(fā)現(xiàn)，采用核糖體DNA(rDNA)區(qū)及rRNA小亞基序列分析，特別是ITS(analysis?of?internal?transcribed?spacer)區(qū)分析比對編碼rRNA小亞基(18SrRNA)基因更適應(yīng)對皮膚真菌檢測，目前，把rDNA的ITS區(qū)序列分析稱為皮膚癬菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。雖然該方法特異、敏感，但需要基因序列的測定及分析，這限制了此方法的應(yīng)用，且一次反應(yīng)僅能鑒定一種真菌，不適合大規(guī)模樣品檢測。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種具有特異性強(qiáng)、敏感性高，成本低，且適合大規(guī)模樣品檢測的兔皮膚真菌復(fù)合PCR檢測方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種兔皮膚真菌復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于,包括以下步驟：

(1)病料DNA提取：疑似感染須癬毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌的病料采用熱裂解的方法提取DNA；

(2)引物的合成：

須癬毛癬菌特異引物：Pa5'GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3'

????????????????????Pb5'GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3'

犬小孢子菌特異引物：Pc5'GACCGCCCGTCGCT?ACTAT3'

????????????????????Pd5'TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3'

絮狀表皮癬菌特異引物：Pe5'GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3'

??????????????????????Pf5'CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3'；

(3)復(fù)合PCR：以病料DNA為模板，Pa-Pf3對引物混合為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(4)PCR產(chǎn)物檢測：采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

前述的兔皮膚真菌復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，PCR的反應(yīng)體系為：Mixtures10μL，三對引物Pa-Pf最終濃度0.2mM，模板DNA4μL，加ddH₂O至總體積20μL。

前述的兔皮膚真菌復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于，在步驟(3)中，PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃初始變性5min,94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min。

前述的兔皮膚真菌復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于，前述須癬毛癬菌特異引物、犬小孢子菌特異引物和絮狀表皮癬菌特異引物的濃度配比為1：1：1。

本發(fā)明的有益之處在于：采用復(fù)合PCR方法，所用樣品量少，經(jīng)過一次PCR就能鑒別3種皮膚真菌。較傳統(tǒng)直接顯微觀察和病原分離培養(yǎng)等方法特異性強(qiáng)、敏感性高、省時(shí)；與其他分子生物學(xué)方法比，減少了PCR次數(shù)，也不需序列測定，具有簡單、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，且非常適合大規(guī)模樣品檢測。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所述的兔皮膚真菌復(fù)合PCR檢測方法的一個(gè)具體實(shí)施例中獲得的電泳圖。