[發(fā)明專利]一種產(chǎn)甲烷泡菌的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410203266.6
• 申請(qǐng)日: 2014-05-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103966330A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 牟伯中;楊世忠;劉金峰;王立影;呂磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 蔣亮珠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種產(chǎn)甲烷泡菌的快速定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

產(chǎn)甲烷泡菌(Methanofollis)屬于甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)，主要存在于厭氧污泥、油藏等環(huán)境中。生長(zhǎng)溫度為20℃～45℃，革蘭氏陰性，大小1.5～3.0μm不規(guī)則球形，一般單生，可以利用甲酸、氫氣/二氧化碳、乙醇等產(chǎn)生甲烷。目前，已報(bào)道的產(chǎn)甲烷泡菌并不多，全部為嚴(yán)格厭氧菌，生長(zhǎng)條件苛刻，目前對(duì)其生理生長(zhǎng)特性也沒(méi)有完全認(rèn)識(shí)，培養(yǎng)方法也知之甚少，培養(yǎng)難度較大，因此依賴培養(yǎng)的方式還無(wú)法對(duì)所有的Methanofollis進(jìn)行系統(tǒng)的定量分析。

在產(chǎn)甲烷泡菌檢測(cè)分析方面，目前還沒(méi)有針對(duì)性的檢測(cè)手段，常規(guī)方法僅僅是通過(guò)16S rRNA基因克隆文庫(kù)的方法對(duì)樣品當(dāng)中含有的產(chǎn)甲烷泡菌首先進(jìn)行定性分析，定性分析需要在提取樣品DNA之后通過(guò)PCR擴(kuò)增、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、挑單菌、測(cè)序、得到測(cè)序結(jié)果并最終通過(guò)序列分析等一系列步驟才能完成。就定量分析而言，目前只能通過(guò)分子生物學(xué)方法確定Methanofollis在樣品中的相對(duì)含量，并結(jié)合樣品總菌濃(如生物顯微鏡計(jì)數(shù)等)進(jìn)行計(jì)算獲得。通常情況下，待測(cè)樣品一般包含多種微生物，而且不同微生物的豐度相差巨大。在采用傳統(tǒng)方法分析時(shí)，一方面，生物顯微鏡計(jì)數(shù)誤差較大，且不能做低濃度檢測(cè)，另一方面，對(duì)于豐度低的產(chǎn)甲烷泡菌可能會(huì)出現(xiàn)漏檢，對(duì)于不同生理特性的產(chǎn)甲烷泡菌，往往因?yàn)榕囵B(yǎng)條件不適也會(huì)造成漏檢，同時(shí)，傳統(tǒng)方法存在著耗時(shí)、過(guò)程繁雜等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種特異性強(qiáng)，操作便捷、檢測(cè)準(zhǔn)確的產(chǎn)甲烷泡菌的檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種產(chǎn)甲烷泡菌的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)樣品中微生物的DNA；

(2)采用特異性引物對(duì)，對(duì)步驟(1)獲得的樣品DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，讀取熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的初始循環(huán)數(shù)；

(3)根據(jù)公式：對(duì)樣品中產(chǎn)甲烷泡菌進(jìn)行定量，C_T為初始循環(huán)數(shù)，N為待測(cè)樣品中產(chǎn)甲烷泡菌(Methanofollis)菌濃。

步驟(2)所述的特異性引物對(duì)序列為：

正向：GTCTCACCAGAACGACTC

反向：TAAGTTTCAGCCTTGCGAC。

步驟(2)所述的熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成包括：4μL無(wú)菌水，12μL通用SYBR綠色熒光染料混合體系(Universal SYBR Green Master Mix)，25μM的正向和反向特異性引物各1μL，2μL標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA或待測(cè)樣品DNA。

步驟(2)所述的熒光定量PCR擴(kuò)增的程序?yàn)閷晒舛縋CR擴(kuò)增的反應(yīng)體系按以下程序進(jìn)行反應(yīng)：a)95℃保溫4min；b)94℃保溫45s；c)60℃保溫30s；d)72℃保溫45s；e)重復(fù)執(zhí)行b)～d)65次；f)從65℃開(kāi)始每5s增加0.5℃至達(dá)到95℃為止。

本發(fā)明的產(chǎn)甲烷泡菌檢測(cè)方法中，提取產(chǎn)甲烷泡菌標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA和待測(cè)樣品DNA的方法按照公司的細(xì)菌組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(Axygen生物科技有限公司，美國(guó))。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足設(shè)計(jì)了特性性的引物，采用特異性引物結(jié)合熒光定量PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA的方法，獲得培養(yǎng)樣品中產(chǎn)甲烷泡菌屬的含量，克服了傳統(tǒng)技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明方法特異性強(qiáng)，操作便捷、檢測(cè)準(zhǔn)確。

附圖說(shuō)明

圖1為標(biāo)準(zhǔn)菌菌濃與初始循環(huán)數(shù)關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。該實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的舉例說(shuō)明，并不意味著對(duì)發(fā)明范圍的限制。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：

取產(chǎn)甲烷泡菌Methanofollis菌液(菌濃4.62×10¹⁰個(gè)/mL)，做10倍梯度稀釋，分別提取10mL稀釋菌液的DNA，溶解到10μL無(wú)菌水中，備用。

采用特異性引物(正向：GTCTCACCAGAACGACTC，反向：TAAGTTTCAGCCTTGCGAC)對(duì)獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下：