[發(fā)明專利]一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410202543.1
• 申請(qǐng)日: 2014-05-14
• 公開（公告）號(hào): CN104031877B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊靜;盧永超;黃荷鳳;盛建中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明專利涉及一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，該模型模擬胚胎植入子宮內(nèi)膜的早期過(guò)程，用于胚胎植入研究。??

背景技術(shù)

近年，由于全球范圍內(nèi)不孕人群數(shù)量持續(xù)增加，使輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用不斷推廣、生殖醫(yī)學(xué)臨床的快速發(fā)展，但是臨床妊娠率提高并不明顯，這就對(duì)生殖醫(yī)學(xué)研究提出了新的要求。胚胎植入子宮內(nèi)膜是妊娠建立的關(guān)鍵步驟，因此胚胎植入子宮內(nèi)膜已經(jīng)成為生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。由于植入時(shí)與內(nèi)膜相互作用的胚胎細(xì)胞數(shù)量少、變化迅速，對(duì)植入相關(guān)生物分子進(jìn)行檢測(cè)困難，有關(guān)胚胎植入子宮內(nèi)膜的具體機(jī)制仍不清楚。因此，建立有效的體外胚胎植入子宮內(nèi)膜模型，方便地對(duì)目標(biāo)細(xì)胞中生物活性分子進(jìn)行檢測(cè)是研究胚胎植入子宮內(nèi)膜的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，旨在應(yīng)用生物工程技術(shù)建立一種新型的體外胚胎植入模型，即胚胎植入子宮內(nèi)膜過(guò)程中滋養(yǎng)細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞相互作用的模型，解決胚胎植入過(guò)程中胚胎來(lái)源細(xì)胞數(shù)量少，又無(wú)從有效分離的難題，為胚胎植入子宮內(nèi)膜的研究提供有效的方法和工具。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，包括以下步驟：

（1）在培養(yǎng)皿A、B中制作兩個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)附著物：將凝膠點(diǎn)為30度的瓊脂糖溶解在TAE緩沖液中，瓊脂糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5%；溶解后將其鋪在兩個(gè)直徑為10cm的培養(yǎng)皿A、B中，凝膠厚度為0.5cm，在4℃下凝固，使用前置室溫復(fù)溫1h。

（2）向培養(yǎng)皿A中加入5ml?RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿B中加入8ml囊胚培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)基用于子宮內(nèi)膜培養(yǎng)；囊胚培養(yǎng)液用于滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，置入37^oC，體積百分比濃度為5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)浸洗平衡3次，每次1個(gè)小時(shí)。

（3）子宮內(nèi)膜蛻膜化處理：將分離純化的個(gè)數(shù)在5×10⁶的子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞或高分化子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿A，加入含有β-雌二醇（E₂）200pg/mL、孕酮（P）20ng/mL的、體積百分比為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液8ml進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行子宮內(nèi)膜分泌化培養(yǎng)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谄谏掀ぁ⒎蛛x純化的個(gè)數(shù)在5×10⁶的滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿B進(jìn)行培養(yǎng)至滋養(yǎng)層細(xì)胞面積占整個(gè)培養(yǎng)皿面積50%-80%。

（4）將長(zhǎng)滿細(xì)胞的其中一種細(xì)胞生長(zhǎng)附著物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)生長(zhǎng)有另一種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞面兩兩相扣，建立胚胎植入時(shí)的兩種細(xì)胞相互作用的狀態(tài)。

（5）24小時(shí)后將兩兩相扣的細(xì)胞生長(zhǎng)附著物取出置于冰塊上，用PBS緩沖液洗滌后剪碎至直徑小于1?mm的小塊(肉眼呈糊狀)。

（6）加入D/F培養(yǎng)基洗滌1次后，依次通過(guò)100目(150????????????????????????????????????????????????)和400目(38)篩網(wǎng)。

（7）400目篩網(wǎng)上主要為內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞或二者形成的細(xì)胞團(tuán)，翻轉(zhuǎn)篩網(wǎng)后，用D/F培養(yǎng)基沖洗，所有沖洗液合并后，1000r/min離心5?min。

（8）用2?ml含體積百分比為0.02%EDTA和體積百分比為0.25%胰蛋白酶消化5-10?min，使細(xì)胞團(tuán)分散成為單個(gè)細(xì)胞。立即加入2ml含體積百分比為10%胎牛血清的滋養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，1000?r/min離心5?min后，應(yīng)用免疫磁珠法（已有專用技術(shù)）分別分離子宮內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞，用于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果在于：應(yīng)用瓊脂糖制作子宮內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)附著物，建立胚胎植入時(shí)的子宮內(nèi)膜面和胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞面，兩兩相互接觸建立胚胎植入時(shí)的細(xì)胞相互作用狀態(tài)，破碎后分別分離純化兩種細(xì)胞，用于早期胚胎植入研究，從而解決研究胚胎植入目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量少的瓶頸，為有效研究早期胚胎植入提供了方便有效的技術(shù)和工具。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1，一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，包括以下步驟：

（1）在培養(yǎng)皿A、B中制作兩個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)附著物：將凝膠點(diǎn)為30度的瓊脂糖溶解在TAE緩沖液中，瓊脂糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5%；溶解后將其鋪在兩個(gè)直徑為10cm的培養(yǎng)皿A、B中，凝膠厚度為0.5cm，在4℃下凝固，使用前置室溫復(fù)溫1h。