[發(fā)明專利]一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410202543.1
• 申請(qǐng)日: 2014-05-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104031877B
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊靜;盧永超;黃荷鳳;盛建中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）在培養(yǎng)皿A、B中加入瓊脂糖凝膠，制作細(xì)胞生長(zhǎng)附著物：將凝膠點(diǎn)為30度的瓊脂糖溶解在TAE緩沖液中至瓊脂糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5%；溶解后將溶液鋪在兩個(gè)直徑為10cm的培養(yǎng)皿A、B中，凝膠厚度均為0.5cm，在4℃下凝固，使用前置室溫復(fù)溫1h；

（2）向培養(yǎng)皿A中加入5ml?RPMI1640培養(yǎng)基，RPMI1640培養(yǎng)基用于子宮內(nèi)膜培養(yǎng)；向培養(yǎng)皿B中加入8ml囊胚培養(yǎng)液，囊胚培養(yǎng)液用于滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)；將培養(yǎng)皿A、B均置于37^oC，CO₂體積百分比濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)浸洗平衡3次，每次1個(gè)小時(shí)；

（3）子宮內(nèi)膜蛻膜化處理：將分離純化的個(gè)數(shù)在5x10⁶的子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞或高分化子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿A，加入含有β-雌二醇（E₂）200pg/mL、孕酮（P）20ng/mL、體積百分比為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液8ml進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行子宮內(nèi)膜分泌化培養(yǎng)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谄谏掀ぃ粚⒎蛛x純化的個(gè)數(shù)在5x10⁶的滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿B進(jìn)行培養(yǎng)至滋養(yǎng)層細(xì)胞面積占整個(gè)培養(yǎng)皿面積50%-80%；

（4）將長(zhǎng)滿細(xì)胞的其中一種細(xì)胞生長(zhǎng)附著物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)生長(zhǎng)有另一種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞面兩兩相扣，建立胚胎植入時(shí)的兩種細(xì)胞相互作用的狀態(tài)；

（5）24小時(shí)后將兩兩相扣的細(xì)胞生長(zhǎng)附著物取出置于冰塊上，用PBS緩沖液洗滌后剪碎至直徑小于1mm的小塊；

（6）加入D/F培養(yǎng)基洗滌1次后，依次通過(guò)100目和400目篩網(wǎng)；

（7）400目篩網(wǎng)上主要為內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞或二者形成的細(xì)胞團(tuán)，翻轉(zhuǎn)篩網(wǎng)后，用D/F培養(yǎng)基沖洗，所有沖洗液合并后，1000r/min離心5?min；

（8）用2?ml含體積百分比為0.02%?EDTA和體積百分比為0.25%胰蛋白酶消化5-10min，使細(xì)胞團(tuán)分散成為單個(gè)細(xì)胞；加入2ml含體積百分比為10%胎牛血清的滋養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5min后，應(yīng)用免疫磁珠法分別分離子宮內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞。