[發明專利]一種擬南芥AAP1基因的克隆及植物表達載體的構建方法

在審

• 申請號: 201410202095.5
• 申請日: 2014-05-09
• 公開（公告）號: CN104046638A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 崔喜艷;張治安;陳展宇;劉相國;佟珊珊;王闊;范貝;鹿丹;劉明曉
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/82;C12N15/66
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技術領域

本發明屬于生物化學技術領域，涉及一種擬南芥AAP1基因的克隆及植物表達載體的構建方法。

背景技術

植物種子貯藏蛋白的合成受多重因素的調節，蛋白積累很大程度上取決于氨基酸的供應。若氨基酸供應充足，即可極大地提高植物體內蛋白質的含量。氨基酸透性酶(AAP)基因是擬南芥中重要的氨基酸轉運蛋白，在主根、側根、根毛及根表皮細胞中發揮重要作用，Yong等研究表明，過表達AAP1基因可以顯著提高了擬南芥中中性氨基酸、谷氨酸鹽和組氨酸的吸收能力，使得根部組氨基酸含量明顯上升，繼而使蛋白含量升高。AAP是由完整的膜蛋白與H+耦合催化氨基酸攝取。AAPs由多基因家族編碼，擬南芥中由八個成員組成，利用基因工程過表達AAP1基因，能夠顯著改善植物根系氨基酸的利用效率，使得根部組氨酸含量明顯上升；AAP1基因在種子中過量表達，可增加種子庫的氮含量，提高植物氮等營養元素，并且可以調節貯藏蛋白的合成；在酵母中表達AAP時，對氨基酸側鏈具有低選擇性。在不同細胞類型的差異表達，表明AAPs在韌皮部對氮的吸收和運輸具有特異性。

目前人們已從分子水平上研究氨基酸載體或轉運蛋白。擬南芥、蓖麻等植物的氨基酸轉運蛋白基因已被分離和鑒定。Chen和Bush將擬南芥ESTcDNAs克隆至缺失氨基酸轉運蛋白的酵母中表達，發現擬南芥細胞質膜存在轉運賴氨酸和組氨酸的專一性轉運蛋白(LHT1)，擬南芥大約有8個氨基酸轉運載體AAP1-8。AAP1主要運輸帶負電荷和中性的氨基酸，AAP2和AAP4主要運輸苯丙氨酸、纈氨酸以及脯氨酸，AAP3與AAP5主要運輸賴氨酸和精氨酸。Boorer和Fisher將在根中表達量多的擬南芥氨基酸轉運子AAP5克隆到爪蟾(Xenopus)卵母細胞內表達，發現AAP5能轉運中性、酸性和堿性等多種氨基酸，但轉運氨基酸以固定的H⁺∶氨基酸＝1∶1進行。由于AAP1基因具有轉運氨基酸的作用，能使得植物中氨基酸含量增加，我們設想可以將AAP1基因轉入普通玉米種，培育出高蛋白玉米，高蛋白玉米具有必需氨基酸含量高、營養富集等特點，是畜牧業養殖的優質飼料；普通玉米的飼用價值高于其它谷物，高蛋白玉米的飼料價值更優于普通玉米，并且AAP1在玉米中的應用和關鍵技術創新工作，國外未見相關報道。

發明內容

本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種擬南芥AAP1基因的克隆及植物表達載體的構建方法，進一步研究擬南芥AAP1基因的功能，本研究從擬南芥中克隆了AAP1基因，構建了擬南芥AAP1基因的植物表達載p3300-AAP1，以及今后利用AAP1基因進行氨基酸、高蛋白植物的遺傳轉化提供理論及實驗基礎。

其具體技術方案為：

一種擬南芥AAP1基因的克隆及植物表達載體的構建方法，包括以下步驟：

1)用TRIzol法提取到擬南芥幼苗的總RNA，反轉錄成cDNA后，根據Primer5.0設計引物進行RT-PCR，上游引物帶有EcoR?I酶切位點，下游引物帶有Xba?I酶切位點：

上游引物：5’CGGAATTCATGAAGAGTTTCAACACAG3’

下游引物：5’GCTCTAGATTGGAAGAGCTCATATGTAT3’

2)將PCR產物進行凝膠回收，回收后的產物與PMD-18T載體進行連接，轉化結束后進行質粒的提取，將提取的質粒進行PCR及酶切驗證，經過質粒PCR驗證，獲得了大約1600bp的DNA條帶；經過雙酶切驗證，分別獲得了2692bp的載體與大約1600bp的目的片段，可初步證明，已經成功克隆出擬南芥AAP1基因；

3)獲得1600bp左右的目的條帶，測序后發現該基因ORF1458bp，編碼485個氨基酸的多肽，根據氨基酸序列推出，該基因編碼一個氨基酸透性酶；在線對蛋白氨基酸序列進行疏水性分析，此程序采用的是Kyte&Doolittle(K-D)法計算氨基酸的親水性或疏水性；程序中分析得知，第460氨基酸處具有疏水性較強的特性，大約在第37個氨基酸和360-370氨基酸左右區域具有較強的親水性；

4)用限制性內切酶EcoR?I和Xba?I將目的基因和pCAMBIA3300載體分別酶切后，將目的基因定向連接到植物表達載體上，經轉化結束后進行質粒的提取，將質粒進行PCR及酶切驗證；質粒PCR驗證，獲得了一條約為1600bp的DNA條帶；經過酶切驗證，分別獲得了約8300bp的pCAMBIA3300載體與約為1600bp的目的片段；說明載體構建成功，重新命名為p3300-AAP1。