[發明專利]一種擬南芥AAP1基因的克隆及植物表達載體的構建方法

在審

• 申請號: 201410202095.5
• 申請日: 2014-05-09
• 公開（公告）號: CN104046638A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 崔喜艷;張治安;陳展宇;劉相國;佟珊珊;王闊;范貝;鹿丹;劉明曉
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種擬南芥AAP1基因的克隆及植物表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)用TRIzol法提取到擬南芥幼苗的總RNA，反轉錄成cDNA后，根據Primer5.0設計引物進行RT-PCR，上游引物帶有EcoR?I酶切位點，下游引物帶有Xba?I酶切位點：

上游引物：5’CGGAATTCATGAAGAGTTTCAACACAG3’

下游引物：5’GCTCTAGATTGGAAGAGCTCATATGTAT3’

2)將PCR產物進行凝膠回收，回收后的產物與PMD-18T載體進行連接，轉化結束后進行質粒的提取，將提取的質粒進行PCR及酶切驗證，經過質粒PCR驗證，獲得了1600bp的DNA條帶；經過雙酶切驗證，分別獲得了2692bp的載體與1600bp的目的片段，可初步證明，已經成功克隆出擬南芥AAP1基因；

3)獲得1600bp左右的目的條帶，測序后發現該基因ORF1458bp，編碼485個氨基酸的多肽，根據氨基酸序列推出，該基因編碼一個氨基酸透性酶；在線對蛋白氨基酸序列進行疏水性分析，此程序采用的是Kyte&Doolittle(K-D)法計算氨基酸的親水性或疏水性；程序中分析得知，第460氨基酸處具有疏水性較強的特性，在第37個氨基酸和360-370氨基酸左右區域具有較強的親水性；

4)用限制性內切酶EcoR?I和Xba?I將目的基因和pCAMBIA3300載體分別酶切后，將目的基因定向連接到植物表達載體上，經轉化結束后進行質粒的提取，將質粒進行PCR及酶切驗證；質粒PCR驗證，獲得了一條為1600bp的DNA條帶；經過酶切驗證，分別獲得了8300bp的pCAMBIA3300載體與為1600bp的目的片段；重新命名為p3300-AAP1。