[發明專利]對綠盲蝽進行RNA干擾的注射方法及其在基因篩選上的應用

有效

• 申請號: 201410201539.3
• 申請日: 2014-05-13
• 公開（公告）號: CN103993079A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 王桂榮;劉方舟;楊婷;劉楊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及對綠盲蝽進行RNAi的注射方法以及利用該方法在篩選綠盲蝽生長發育關鍵基因上的應用。?

背景技術

隨著Bt棉花的大面積種植，棉鈴蟲的為害得到了有效地控制，然而綠盲蝽逐漸成為為害我國農業生產，尤其是棉田的重要害蟲，發生面積占種植面積的90％左右，嚴重威脅棉花生產，導致棉花產量損失10％～20％。此外，綠盲蝽在為害棉花的同時，還影響栆、桃、櫻桃、蘋果和葡萄等農作物的生產。目前，對綠盲蝽的防治措施主要依靠化學防治。然而，長期大量使用農藥進行害蟲防治不僅會殺傷天敵、降低田間作物的自然調節能力、對自然環境造成污染、破壞生態平衡，而且長此以往，會增加綠盲蝽對化學農藥產生抗性的風險。因此，開發一條經濟有效、環境友好的綠色防治途徑來控制綠盲蝽的危害成為當前迫在眉睫的重要任務之一。?

RNA干擾(RNAi)技術是當今研究基因功能以及健康有效防治害蟲的一個重要手段和研究熱點。利用注射的方法進行RNAi實驗用以篩選昆蟲生長發育關鍵基因，在此基礎上發展有效的抗蟲轉基因作物，可以為害蟲防治提供一條新的可行途徑。RNAi是由雙鏈RNA引發的基因沉默現象，其作用機制是通過誘發對同源mRNA的高效特異性降解來干擾目標基因的表達。當與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA導入細胞時，其被降解成21-23bp長度的小分子RNA即siRNA，RNA誘導沉默復合體(RNA-induced?silencing?complex,RISC)結合siRNA并將其解旋成單鏈，引導單鏈siRNA根據堿基互補配對原則特異性地結合同源mRNA(靶標)，使mRNA發生斷裂而導致基因表達沉默。?

RNAi是基因功能研究的一個革命性的發現，它極大的擴展了基因研究的思路和方法。從發現至今，RNAi技術在人類醫學，基因工程以及農業等各個領域得以應用，并取得了很多突破。在醫學方面，此技術已被用于臨床疾病治療，如老年視黃斑退化、肌肉萎縮性側索硬化癥、類風濕性關節炎、肥胖癥等。在農業害蟲防治領域，2007年Baum等人在鞘翅目昆蟲西方玉米根蟲(WCR)中利用RNAi技術沉默290個基因后，發現其中125個基因有明顯致死效果。至今為止，RNAi技術主要在雙翅目、膜翅目、同翅目、鞘翅目、等翅目、鱗翅目和直翅目7個目中的15種昆蟲中得到成功應用。由于RNAi現象在昆蟲綱中是存在的，某些基因RNAi沉默后能夠導致昆蟲的死亡，所以如果能夠利用轉基因植物表達出特異的dsRNA，讓?昆蟲在取食過程中攝入，對某些農業害蟲的生長發育進行控制，從而能夠將這種RNAi介導的轉基因植物發展成一種害蟲控制的新策略，為有效控制和防治農業害蟲提供一條可行的途徑和良好的前景。?

然而，由于利用RNAi技術培育轉基因植物，周期長，成本高，不能實現從大量基因中篩選功能基因，所以在成功發展轉基因植物之前能夠尋找既經濟又簡單快捷的方法篩選鑒定大量基因從而找到候選基因顯得尤為重要。?

同時，有關半翅目昆蟲RNAi實驗的報道中，尚未有任何關于綠盲蝽抗蟲基因及綠盲蝽RNAi的實驗報告。因此，從綠盲蝽的大量基因中篩選鑒定對其生長發育起關鍵作用并在RNAi后能夠影響其生長并導致死亡的基因，可以為接下來利用RNAi發展轉基因植物，用以防治當前棉花重要害蟲綠盲蝽提供重要的依據和基礎，從而降低殺蟲藥劑使用量以及綠盲蝽抗藥性的產生，避免新的生態問題產生，具有重要的經濟、生態和社會效益。?

雖然目前已經有關于，但是在技術方案之前，向綠盲蝽導入dsRNA能否引發RNAi效果并產生致死表型不得而知。?

發明內容

本發明提供一種對綠盲蝽進行RNAi實驗的注射方法，對綠盲蝽進行RNAi實驗的注射參數(包括注射位置、注射體積，注射dsRNA總量)進行確定，并挑選了綠盲蝽持家基因β-actin驗證綠盲蝽導入dsRNA能否引發RNAi效果并產生致死表型，結果表明導入β-actin基因dsRNA可以導致綠盲蝽生長發育受到嚴重不利的影響，甚至死亡的結論。該方法為篩選新的抗蟲基因提供新的技術手段和平臺，為發展抗綠盲蝽轉基因作物提供新的基因資源進而依此達到發展經濟有效，環境友好的新的方法來控制綠盲蝽的危害。?

對綠盲蝽進行RNAi實驗的注射方法，其特征在于：注射位置為后胸與腹部節間膜的最外側。?

所述用于注射的dsRNA濃度為10μg/μl，注射體積為41.4nl。?

所述綠盲蝽為3L若蟲。?