[發明專利]對綠盲蝽進行RNA干擾的注射方法及其在基因篩選上的應用

有效

• 申請號: 201410201539.3
• 申請日: 2014-05-13
• 公開（公告）號: CN103993079A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 王桂榮;劉方舟;楊婷;劉楊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

1.對綠盲蝽進行RNAi實驗的注射方法，其特征在于：注入dsRNA的注射位置為后胸與腹部節間膜的最外側。

2.根據權利要求1所述的注射方法，其中用于注射的dsRNA濃度為10μg/μl，注射體積為41.4nl。

3.根據權利要求2所述的注射方法，所述綠盲蝽為3L若蟲。

4.一種建立綠盲蝽生長發育關鍵基因的篩選方法，包括如下步驟：(1)取綠盲蝽總RNA，通過RT-PCR得到cDNA；(2)選定目標基因一段特異性片段，設計帶有T7序列的特異性引物；(3)通過PCR技術擴增目的基因片段：以第一步得到的cDNA為模板，第二步設計的特異引物擴增，得到帶有T7序列和目的基因片段的PCR產物；(4)構建含有選定目的基因片段的載體：將目的基因片段用T4DNA連接酶插入載體PGM-T中，轉入宿主大腸桿菌中，富集培養，提取含有目的基因片段的質粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的質粒為模板，第二步設計的特異性引物擴增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR產物；(6)利用T7RNA聚合酶將上一步得到的PCR產物合成為目的基因片段dsRNA；(7)將dsRNA按權利要求1-3任一所述的注射方法導入綠盲蝽的體內，持續飼養記錄若蟲經RNAi后的表現型；(8)統計死亡率，確認該目的基因與生長發育的關系。

5.根據權利要求4所述的篩選方法，所述特異性片段為400-500bp。

6.根據權利要求4所述的篩選方法，所述目的基因為綠盲蝽β-actin基因，其序列如SEQ?ID?NO1所示。

7.根據權利要求6所述的篩選方法，所述綠盲蝽β-actin基因的特異性片段序列如SED?ID?NO4所示。

8.根據權利要求4所述的篩選方法，所述步驟(7)的同時，將GFP基因的dsRNA作為對照組注射入綠盲蝽體內，所述GFP基因序列如SEQ?ID?NO2所示。

9.根據權利要求8所述的篩選方法，所述GFP基因的特異性片段序列如SEQ?ID?NO3所示。

10.根據權利要求4所述的篩選方法，持續飼養時間為5-10天。