[發明專利]惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒及核苷酸序列

有效

• 申請號: 201410201466.8
• 申請日: 2014-05-14
• 公開（公告）號: CN103937907B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 劉翌;王飛;田茵;孫寧;楊靜;孫福軍;劉艷華;薛強;高璟瑜;張紹福;鄒明強;鄧叢良;葛廣路
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司12209
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明屬于檢驗檢疫領域，但不限于該領域，涉及檢測臨床樣品中惡性瘧原蟲，是一種惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒及核苷酸序列。

背景技術

瘧疾是對人類健康危害最嚴重的傳染病之一，瘧疾病例中有86％發生在非洲地區，非洲以外地區的瘧疾病例80％集中在印度、蘇丹、緬甸、孟加拉、印度尼西亞、巴布亞新幾內亞和巴基斯坦等國。非洲以惡性瘧為主，間日瘧分布最廣，遍及熱帶、亞熱帶、溫帶的國家和地區，以中美洲和東南亞為多見。

我國自2000年以來瘧疾疫情出現回升，其中云南、海南兩省較為嚴重，許多省受到輸入性惡性瘧的威脅，尤其是境外輸入性惡性瘧的威脅。隨著經濟全球化和國際交往的增多，近年來勞務輸出人數逐年增加，輸入性瘧疾病例逐年增多，呈逐年上升趨勢。輸入性病例大多源于非洲、緬甸等惡性瘧高發區勞務輸出的歸國人員，2008年我國瘧疾死亡病例全部為境外勞務回國人員，2009年有21個省(市、區)有輸入性惡性瘧病例報告，且瘧疾死亡也全部為輸入病例。因此，關注瘧疾疫情，特別是境外輸入性惡性瘧疫情十分重要。

2009年全國報告惡性瘧1027例，占瘧疾總報告病例數的7.4％。其中，當地感染的惡性瘧130例，占惡性瘧報告病例數的12.7％，輸入性惡性瘧病例897例，占惡性瘧報告病例數的87.3％。2010年全年報告惡性瘧1258例，占瘧疾總報告病例數的16.0％，其中報告當地感染的惡性瘧97例，占惡性瘧報告病例數的7.7％，報告輸入性惡性瘧1161例，占惡性瘧報告病例數的92.3％，較上年上升29.4％。輸入性惡性瘧最主要的感染地為東南亞地區和非洲。東南亞有緬甸、柬埔寨、巴基斯坦、印度、印度尼西亞、馬來西亞等國家。非洲地區有尼日利亞、安哥拉、馬里、加納、幾內亞、赤道幾內亞、剛果、利比里亞、利比亞、馬拉維、多哥、喀麥隆、莫桑比克、科特迪瓦、南非和肯尼亞等國家，其中東南亞的緬甸，非洲地區的尼日利亞、安哥拉、幾內亞、赤道幾內亞，是我國輸入性惡性瘧最多的國家。

惡性瘧來勢兇險，臨床表現復雜多變，熱型不規則，起病方式各異，有的表現為呼吸道感染，有的表現為消化道感染，有的表現為急腹癥。并且惡性瘧可隨時出現嚴重并發癥，如腦型瘧、急性血管內溶血(亦稱黑尿熱)等，容易引起誤診，若不及時救治，可出現意識障礙、昏迷、偏癱、腎功能衰竭、呼吸衰竭而死亡，病死率可達22％-50％，甚至高達70％。因此，惡性瘧的早期診斷對于及早實施有效的治療方案，減少重癥病例及死亡病例、防范“二代”病例的發生十分重要。

發熱病人血檢是全世界公認的和推行的發現傳染源唯一可靠可行的辦法，在瘧疾檢測中占有很重要的地位。鏡檢仍是診斷瘧疾的金標準，但其敏感性低，費時費力，漏檢率高，還需要有相當經驗的檢驗人員才能做到正確診斷，尤其是在低原蟲血癥、混合感染，以及需要大樣本人群現場檢測時，臨床應用受到許多限制。因此，迫切需要研制出新的敏感、特異、快速、方便的惡性瘧診斷技術。

實時熒光定量PCR技術與傳統的PCR技術相比具有特異性和敏感性更強、自動化程度更高以及污染可能性更小等優點。

TaqMan實時熒光定量PCR技術依據目的基因設計合成了一條能夠與之特異性雜交的探針，探針結合位置位于上下游引物之間，當擴增延伸到探針結合的位置時，Taq酶利用5’→3’外切酶活性，將探針5’端連接的熒光基團從探針上解離下來，破壞了兩個熒光基團之間的熒光共振能量轉移(fluorescenceresonance?energytransfer，FRET)，而發出熒光，解離下來的熒光分子數與PCR產物的數量成正比，因此根據反應體系中的熒光強度即可計算初始模板的數量。

惡性瘧原蟲的實時熒光定量PCR檢測，包括兩大步驟，首先是從標本中將惡性瘧原蟲核酸提取出來，然后再用實時熒光定量PCR技術對目的基因進行檢測。瘧原蟲的裂殖子進入紅細胞內發育增殖，被感染的紅細胞最終被脹破，裂殖子、瘧色素和其他代謝產物一起進入血流，引起一次臨床發病。瘧原蟲檢測標本，通常有兩種，全血標本和濾紙干血片標本，后者由于便于現場采集、保存和運輸，可以滿足現場人群大規模篩查瘧疾采樣、特殊情況下(如在口岸現場)采樣或在邊遠地區采樣的需要，被廣泛采用。