[發明專利]惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒及核苷酸序列

有效

• 申請號: 201410201466.8
• 申請日: 2014-05-14
• 公開（公告）號: CN103937907B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 劉翌;王飛;田茵;孫寧;楊靜;孫福軍;劉艷華;薛強;高璟瑜;張紹福;鄒明強;鄧叢良;葛廣路
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司12209
• 代理人: 王來佳

1.一種惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括如下組分：納米磁微粒、標本稀釋液、裂解液、結合液、洗液、洗脫液、實時熒光PCR反應液、質粒標準品、陽性對照、陰性對照；

所述的納米磁微粒為用無水乙醇配制的納米磁微粒溶液；

所述標本稀釋液為磷酸鹽緩沖液PBS；

所述裂解液為5M異硫氰酸胍溶液；

所述結合液為無水乙醇；

所述洗液為70％乙醇；

所述洗脫液為TEpH8.0；

所述實時熒光PCR反應液包括上游引物F1，見序列1，下游引物R1，見序列2和熒光探針P1，見序列3；

所述的質粒標準品為含有惡性瘧原蟲基因片段(S)的質粒；

所述的陽性對照為惡性瘧原蟲質粒標準品；

所述的陰性對照為正常人全血核酸提取液。

2.根據權利要求1所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于：瘧疾疑似病例全血標本通常有兩種形式，一種是抗凝全血標本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指，抗凝劑采用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉，置于2-8℃或-20℃保存，供核酸提取用；一種是濾紙干血片標本，取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙上，室溫晾干后放入塑料袋密封，置于常溫18-25℃或2-8℃或-20C保存，供核酸提取用。

3.根據權利要求1所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述Fe₃O₄納米磁微粒分離提取全血標本和濾紙干血片標本中惡性瘧原蟲DNA的步驟分述如下：

所述納米磁微粒MNP分離提取全血標本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為：

⑴在1.5mL離心管中加入裂解液150μL，加入惡性瘧疑似病人全血標本50μL，標本量不足50μL時，用標本稀釋液補足，渦旋或顛倒混勻，56℃10min；

⑵加入200μL結合液，加入20μLMNP,25μg/μL，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置10min，用磁鐵吸附MNP，棄上清；

⑶加入300μL洗液清洗MNP，用磁鐵吸附MNP，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；

⑷加入50μL洗脫液，將MNP吹打混勻，56℃5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。

4.根據權利要求3所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述納米磁微粒MNP分離提取全血濾紙干血片標本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為：

⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標本，約1cm²大小，血量約為15-30μL，剪成紙條，放入1.5mL離心管中，向其中加入100μL的標本稀釋液，加入裂解液150μL，渦旋或顛倒混勻，56℃10min；8000rpm離心1min，吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；

(2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200μL結合液，加入20μLMNP,25μg/μL，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置10min，用磁鐵吸附MNP，棄上清；

⑶加入300μL洗液清洗MNP，用磁鐵吸附MNP，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；

⑷加入50μL洗脫液，將MNP吹打混勻，56℃5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。

5.一組惡性瘧原蟲實時熒光定量PCR檢測用核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列為序列1、序列2、序列3，其中序列1為上游引物、序列2為下游引物、序列3為熒光探針。

6.根據權利要求5所述的一組惡性瘧原蟲實時熒光定量PCR檢測用核苷酸序列，其特征在于：所述上游引物、下游引物、熒光探針的濃度為：上游引物200nM，下游引物200nM，熒光探針120nM。