[發(fā)明專利]一種黃粉蟲胰蛋白酶樣酶基因核苷酸序列及克隆方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410201202.2
• 申請(qǐng)日: 2014-05-14
• 公開（公告）號(hào): CN104131016A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓雅莉;譚竹鈞;葉韻;于曉謙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/57
• 分類號(hào): C12N15/57;C12N15/10
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務(wù)所有限公司 44228
• 代理人: 劉媖

1.一種黃粉蟲胰蛋白酶樣酶基因核苷酸序列，其特征在于：其cDNA序列由869個(gè)核苷酸組成，自5’至3’端序列為：

ACACTTCTCACAATGAAATCAATCTTGTTTGTAGTCTTCTTGGTAGCTTCCGCCTCAGCGGTCCCACCTTTCCTCCGCAAGAACAGCTTGCTGCCTGATGGCAGAATCGTAGGAGGCTCCAGCATTTCCATCTCTTCGGTCCCATGGCAAATCTCTCTCCAATACTACGGTTCCCACATCTGCGGTGGTTCAATAATCAGCGCTAACTACATTGTTACTGCTGCCCATTGTACCGATGGATTGACTGCTGGTTCTTTGACCGTCCGTGCTGGAACTTCCACTCGTGGTTCCGGTGGTCAGGTGGTCAACGTCGCTAGGATTAACCAAAATCCCAGCTACAATGACAGGCTCATCGATTATGACATCTCGGTTTTGCAACTGTCTTCGTCTTTGTCTCTGGGCAGCAGCGTAGCCGCTGTAGGCCTTCCATCGTCGAGCACCAGCTGGTCCGCTGGTACTTCCGTTCTCGTAACTGGCTGGGGAACCACCACCGAGGGTTCAAGCTCGCTTCCCTCCGCCTTGCAAGGAGTCAACGTTCAAATTGTTAGCCAATCGACCTGCTCATCCGCATACGGTTCTGGTAGCATCACCGACCGCATGTTGTGCGCTGGTGTTACCGGAGGCGGAAAAGATGCTTGCCAAGGAGACTCCGGCGGTCCACTTGTTGTCGGCAACGTTCTTGCCGGTATCGTCTCTTGGGGATATGGATGTGCCCGCAATGGTTATCCTGGAGTTTATTCTAACGTACCTGCTCTCCGCAGCTACATCCAACAAACCGCCGGAATATAAACTCTTTAAATACTTGTTGCCGCTAATTACGTAAACGACACGGATATGACAATAAATATTTAGTTTTCAAAAAAAAAAAA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃粉蟲胰蛋白酶樣酶基因核苷酸序列，其特征在于：所述的黃粉蟲胰蛋白酶樣酶基因編碼氨基酸序列為第13-786位核苷酸，終止密碼子序列是TAA，位于第787-789位核苷酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃粉蟲胰蛋白酶樣酶基因核苷酸序列，其特征在于：所述的774個(gè)核苷酸序列編碼258個(gè)氨基酸，其序列為：

MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPALRSYIQQTAGI。

4.一種黃粉蟲胰蛋白酶樣酶基因核苷酸序列的克隆方法，其特征在于：包括如下步驟：

黃粉蟲總RNA的提取、mRNA的反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增得到一個(gè)基因黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守序列、根據(jù)黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守序列設(shè)計(jì)特異的5’RACE以及3’RACE的下游和上游特異外引物和特異內(nèi)引物、PCR擴(kuò)增得到該基因5’端序列以及3’端序列，將已知的5’端序列和3’端序列拼接得到完整的地鱉蟲纖溶酶基因核苷酸序列；具體步驟如下：

（1）黃粉蟲總RNA提取

取-80℃保存的黃粉蟲兩只，0.1%的DEPC水清洗，置于已用液氮預(yù)冷的無RNA酶的研缽，用液氮快速冷凍并研磨成粉末狀，取其中約50mg，按照華舜生物技術(shù)有限公司提供的柱式小量總RNA抽提試劑盒W7001提取黃粉蟲總RNA，并獲得約50μl?總RNA，-80℃保存；

（2）mRNA的反轉(zhuǎn)錄

20μl?反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，含5.0μl?總RNA，1.0μl?oligo(dT)₁₈，1.0μl?dNTPs，4.0μl?5×buffer，2.0μl?RNase?inhibitor，1.0μl??Super?M-MLV?Reverse?Transcriptase?RNase?H^-，無RNA酶雙蒸水補(bǔ)至20μl，30℃10min，42℃60min，70℃15min終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，冰浴冷卻后放入-20℃冰箱保存；

（3）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段的核苷酸序列的獲得

1）引用土鱉蟲纖溶酶基因簡并引物序列

上游引物（Primer1）5’-CTN?ACY?GCW?GCY?CAY?TG-3’?簡并度64，編碼氨基酸序列LTAAHC；下游引物（Primer2）5’-CC?NCC?NGA?RTC?WCC?CT-3’，簡并度64，編碼氨基酸序列QGDSGG其中R=A+G??Y=T+C??W=A+T??N=A+T+G+C；

2）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段的PCR擴(kuò)增

采用25ul反應(yīng)體系，采用如下反應(yīng)條件、步驟：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物?1.0μl，10×2.5μl?Buffer：0.5mol/L?KCl，0.1mol/L?Tris-HCl，pH8.4，2.0mmol/L?MgCl₂，dNTPs?0.2mmol/L?2.0μl，Primer1：1μmol/L?2.5μl，Primer2：1μmol/L?2.5μl，TaqDNA聚合酶1.0U；梯度PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃，5min；94℃，30sec，38℃、39.5℃、41.6℃、44.7℃、48.5℃、52.2℃、55.5℃、58.9℃、62.5℃、65℃各1?min，72℃，2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，在退火溫度為55.5℃時(shí)，出現(xiàn)特異條帶，退火溫度定為55℃；

3）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段的回收

參考takara?的Agarose?Gel?DNA?Purification?Kit?Ver?2.0?的使用說明書進(jìn)行，①PCR產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下用潔凈的手術(shù)刀割下含需回收DNA瓊脂塊；②按每3μl/μg瓊脂糖凝膠比例加入DR-ⅠBuffer，置75℃金屬浴6min，使膠徹底融化，每2min混勻一次；③加入1/2DR-ⅠBuffer?體積的DR-ⅡBuffe，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到spin?colum中，12000rpm室溫下離心1min；④取下spin?colum，倒掉收集管中的廢液，將spin?colum放入同一個(gè)收集管中，加入500μl?Ainse?A，12000rpm室溫離心1min；⑤取下spin?colum，倒掉收集管中的廢液，將spin?colum放入同一個(gè)收集管中，加入700μl?Ainse?B，12000rpm室溫離心1min；⑥重復(fù)一次；⑤取下spin?colum，倒掉收集管中廢液，將spin?colum放入同一個(gè)收集管中，12000rpm室溫離心1min；將UNIQ－10柱放入一新1.5ml離心管中，在柱子膜中央加25μl?60℃Elution?Buffer，室溫放置2min；12000rpm室溫離心1min，離心管中液體即為回收的DNA片段；

4）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段的測序

黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段經(jīng)Agarose?Gel?DNA?Purification?Kit?Ver?2.0回收后，克隆至載體pMD19-T中，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，篩選陽性克隆，進(jìn)行DNA測序；

（4）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶5’端片段的獲得

1）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶5’端片段特異引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)已獲得的黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段序列，設(shè)計(jì)下游特異外引物（Primer3?5A3O）5’-GCA?GGT?CGA?TTG?GCT?AAC?A-3’以及并下游特異內(nèi)引物（Primer3?5A4I）5’-TTG?AAC?CCT?CGG?TGG?TGG?TT?-3’；

2）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶5’端片段的PCR擴(kuò)增

根據(jù)takara的5’-Full?RACE?Kit的操作說明完成；

3）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶5’端片段的回收

同黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段；

4）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶5’端片段的測序

同黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段；

（5）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶3’端片段的獲得

1）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶5’端片段特異引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)已獲得的黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段序列，設(shè)計(jì)上游特異外引物（Primer3?3A5O）5’-CCA?GCT?GGT?CCG?CTG?GTA?CT?-3’以及并上游特異內(nèi)引物（Primer3?3A6I）5’-CTC?ATC?CGC?ATA?CGG?TTC?T?-3’；

2）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶3’端片段的PCR擴(kuò)增

根據(jù)takara的3’-Full?RACE?Kit的操作說明完成；

3）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶3’端片段的回收

同黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段；

4）黃粉蟲胰蛋白酶樣酶3’端片段的測序

同黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段；

（6）完整地鱉蟲纖溶酶基因序列的獲得

將黃粉蟲胰蛋白酶樣酶5’端片段的序列與黃粉蟲胰蛋白酶樣酶中間保守片段以及黃粉蟲胰蛋白酶樣酶3’端片段的序列進(jìn)行拼接，即得完整地鱉蟲纖溶酶基因序列；

（7）地鱉蟲纖溶酶基因核苷酸序列測定結(jié)果

地鱉蟲纖溶酶基因序列由869個(gè)核苷酸組成，見序列表，編碼268個(gè)氨基酸，見序列表；編碼氨基酸序列為13-786位核苷酸，終止子密碼位于基因787-789位，終止密碼為TAA，1-12為5’末端非編碼序列，790-869為3’末端非編碼序列。