[發(fā)明專利]一種結(jié)合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410201006.5
• 申請(qǐng)日: 2014-05-09
• 公開（公告）號(hào): CN103948962A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊寧;石璐;張魯杰;張浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61L27/22
• 分類號(hào): A61L27/22;A61L27/16;A61L27/54;A61L27/52;A61L15/32;A61L15/24;A61L15/44;A61K47/42;A61K47/32;C08J3/24;C08J3/075
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【技術(shù)領(lǐng)域】：本發(fā)明涉及生物材料、組織工程和高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法。

【背景技術(shù)】：生物醫(yī)學(xué)組織工程是一個(gè)涉及細(xì)胞生物學(xué)、材料科學(xué)、反應(yīng)器工程和臨床醫(yī)學(xué)的多學(xué)科交叉研究領(lǐng)域。其目的在于構(gòu)建新的組織和器官。最初認(rèn)為，所謂組織工程就是將細(xì)胞置于適合的反應(yīng)器條件下進(jìn)行三維培養(yǎng)，使其構(gòu)建成為組織，并進(jìn)而發(fā)展成為人體器官的替代物。組織工程的三要素就是支架材料、種子細(xì)胞和生長因子。

用于組織工程的支架材料必須具有良好的生物相容性；良好的細(xì)胞親和性；合適的生物降解性和降解速率；可負(fù)載生長因子及傳遞生物信號(hào)等特點(diǎn)。目前可用于組織工程的支架材料有：無機(jī)材料，羥基磷灰石、磷酸鈣；天然高分子材料，殼聚糖、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸、絲膠、聚谷氨酸；合成材料，聚乳酸、聚己內(nèi)酯等。

水凝膠是一類引起組織工程領(lǐng)域極大關(guān)注的生物材料。因?yàn)樗z具有高度的生物相容性以及可與軟組織媲美的機(jī)械特性。水凝膠是以水為分散介質(zhì)的凝膠，在具有網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)的水溶性高分子中引入一部分疏水基團(tuán)和親水殘基，親水殘基與水分子結(jié)合，將水分子連接在網(wǎng)狀內(nèi)部，而疏水殘基遇水膨脹形成交聯(lián)聚合物。

聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)具有溫度敏感性，其LCST約為32℃。Okano等根據(jù)PNIPAAm的疏-親水性間可逆變化的特性，將PNIPAAm以共價(jià)鍵形式固定在聚苯乙烯板(TCPS)表面進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。37℃時(shí)細(xì)胞在TCPS表面粘附增殖，當(dāng)溫度由37℃降至32℃時(shí)，TCPS由疏水性轉(zhuǎn)化為親水性，即接枝有PNIPAAm的TCPS吸水膨脹，整體細(xì)胞群則在保持細(xì)胞間連接狀態(tài)下以片狀的形態(tài)得以脫附，這種方法經(jīng)濟(jì)、方便，可以更好地保持細(xì)胞的分化特性及細(xì)胞的完整性。然而此類凝膠存在機(jī)械性能差、易碎、生物相容性差等缺點(diǎn)，不利于在組織工程等領(lǐng)域應(yīng)用。

γ-聚谷氨酸是由谷氨酸單體通過α-氨基和γ-羧基以酰胺鍵的方式縮合而成的一種多肽型高分子。γ-PGA具有良好的生物相容性和生物降解性，可單獨(dú)使用或者與傳統(tǒng)的組織工程材料結(jié)合用于組織修復(fù)，引入γ-PGA可改善材料的細(xì)胞親和性，更有利于細(xì)胞的粘附和增殖；也可用于藥物載體提供藥物緩釋性和靶向性。

干細(xì)胞是人體及各種組織細(xì)胞的最初來源，具有高度的自我復(fù)制能力、高度增殖和多向分化性能，可分化成多種功能細(xì)胞及組織器官，在治療各種細(xì)胞損傷性疾病等方面擁有極強(qiáng)的優(yōu)越性。胚胎干細(xì)胞(ES)/誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)比其它干細(xì)胞更為原始，其擴(kuò)增能力更強(qiáng)，具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。但是胚胎干細(xì)胞面臨著倫理道德和法律問題，使得iPS細(xì)胞的出現(xiàn)，在干細(xì)胞研究領(lǐng)域、表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域以及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域都引起了強(qiáng)烈的反響。

細(xì)胞生長因子在促進(jìn)干細(xì)胞自我更新和定向分化的過程中扮演著重要的角色，但是生長因子都是分子量不大的可溶性多肽，對(duì)于微環(huán)境中的pH值變化、有機(jī)溶劑、超聲波及酶等都非常敏感，易于變性或降解，而且生長因子的半衰期較短，如果采用傳統(tǒng)的將生長因子加入細(xì)胞培養(yǎng)液的方式，其誘導(dǎo)作用將很快失效；同時(shí)，過量的生長因子加入會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的癌變。因此，細(xì)胞支架材料設(shè)計(jì)必須能夠穩(wěn)定生長因子的活性并達(dá)到對(duì)其控制釋放的目的。肝素和硫酸化蛋白多糖等通過靜電相互作用來保持生長因子在體內(nèi)的穩(wěn)定性。據(jù)報(bào)道肝素、硫酸化蛋白多糖和合成的類肝素都具有保護(hù)生長因子活性的作用，因?yàn)楫?dāng)硫酸化多糖和生長因子相結(jié)合時(shí)，多糖中的硫酸化基團(tuán)首先和生長因子中的堿性氨基酸殘基相結(jié)合，使其不被迅速降解。因此肝素與類肝素物質(zhì)通過與生長因子的特異結(jié)合性，控制其緩慢釋放，從而更好地發(fā)揮生長因子對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)及刺激分化作用。硫酸化的γ-PGA與肝素結(jié)構(gòu)類似，同時(shí)是一種微生物發(fā)酵產(chǎn)物、可降解、降解產(chǎn)物無毒，無異源病毒污染，并且比肝素使用更加安全、可靠。所以可采用γ-PGA-S72作為溫敏水凝膠載體中保護(hù)生長因子活性和控制釋放生長因子的大分子物質(zhì)，制備功能性生物載體。

查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前尚無將γ-PGA-S72和PNIPAAm相結(jié)合的報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明綜合考慮了γ-PGA-S72的生物相容性和能夠保護(hù)生長因子緩慢釋放的特點(diǎn)，采用半互穿網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，將γ-PGA-S72引入到PNIPAAm水凝膠網(wǎng)絡(luò)中，制備得到結(jié)合生長因子型溫敏水凝膠生物載體，提高傳統(tǒng)水凝膠的生物相容性、溫度響應(yīng)性、細(xì)胞片層脫附和保護(hù)并緩慢釋放生長因子等特性。