[發明專利]一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法

有效

• 申請號: 201410201006.5
• 申請日: 2014-05-09
• 公開（公告）號: CN103948962A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 楊寧;石璐;張魯杰;張浩
• 申請（專利權）人: 天津工業大學
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/16;A61L27/54;A61L27/52;A61L15/32;A61L15/24;A61L15/44;A61K47/42;A61K47/32;C08J3/24;C08J3/075
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1.一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

1)γ-PGA-S72單體的合成：將γ-聚谷氨酸和牛磺酸在室溫下溶解于0.5M碳酸氫鈉溶液中，待溶解完全后將反應液置于4℃的冰水浴中冷卻降溫，待冷卻后加入縮合劑EDC·HCl攪拌30min，之后將反應液置于室溫攪拌24h，50000分子量透析袋透析，冷凍干燥制得γ-PGA-S72單體；

2)溫敏水凝膠生物載體的制備：將NIPAAm和γ-PGA-S72溶解于去離子水中，NIPAAm和γ-PGA-S72單體在水溶液中的質量百分比濃度分別為3～5％和2～8％，20～25℃攪拌25～45min至完全溶解，將反應液置于冰水浴中冷卻降溫至0～4℃，加入質量百分比濃度為2～6％的交聯劑攪拌均勻，在N₂保護和磁力攪拌下加入質量百分比濃度為0.5～2％的引發劑水溶液，攪拌5～15min后，向混合液中加入促進劑50～120μL，攪拌30～60s，將溶液緩慢倒入厚度為1.5mm的玻璃器皿中，密封后進行原位自由基聚合反應，控制反應溫度在20～25℃，24～48h后停止反應；

3)溫敏水凝膠生物載體的純化：將反應后的產物用直徑為18mm的打孔器進行打孔，浸泡于去離子水中7～10天，每間隔6～8小時更換去離子水，以除去未完全反應的單體、交聯劑和各種雜質，制得所述的溫敏水凝膠生物載體；

4)溫敏水凝膠生物載體與生長因子的結合：將步驟3所得的溫敏水凝膠置于體積濃度為75％的酒精中浸泡30min進行滅菌，之后用無菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，將凝膠浸泡于濃度為50ng/ml的含有0.1％BSA的PBS溶液中4℃10h，之后用PBS沖洗3次，制得結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體。

2.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法，其特征在于：所述的N-異丙基丙烯酰胺單體分子結構中存在著一定比例的疏水基團異丙基-CH(CH₃)₂，以及親水基團酰胺基團-CO-NH-，它們會競爭性地和水分子產生氫鍵作用力。在較低溫度下及外界溫度小于PNIPAAm的低臨界溶解溫度LCST≈32℃時，PNIPAAm與水分子之間的相互作用力主要體現為酰胺基團和水分子之間的氫鍵作用，此時分子鏈呈現伸展的線團構象，隨著溫度升高，當T＞LCST時，部分與水分子形成的氫鍵被破壞，PNIPAAm大分子內酰胺鍵之間會形成氫鍵，形成疏水層，將水分子排出。由于PNIPAAm在人體生理溫度附近LCST≈32℃表現出優良的溫度響應性，使得它在組織工程溫敏支架材料中得到廣泛的應用。

3.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法，其特征在于：所述的γ-聚谷氨酸是由谷氨酸單體通過α-氨基和γ-羧基以酰胺鍵的方式縮合成的一種多肽型高分子，γ-PGA的分子鏈上含有大量的活性較高游離側鏈羧基-COOH，使得它具有極好的吸水保濕性，易于與一些藥物形成穩定的復合物，是一類理想的可生物降解的生物醫用高分子材料。

4.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法，其特征在于：所述的γ-PGA-S72單體中磺酸基團-SO₃H和羧基-COOH的相對含量之比恰好適合與生長因子中陽離子氨基酸結合，從而對溫敏水凝膠生物載體起到了增強生物相容性和保護緩慢釋放生長因子的作用。

5.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法，其特征在于：所述的交聯劑是N，N-亞甲基雙丙烯酰胺，所述的引發劑為過硫酸銨或過硫酸鉀，所述的促進劑為N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。

6.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法，其特征在于：所述的水凝膠溶脹后外觀為透明狀，當外界溫度升至31～35℃后，水凝膠立刻由透明色變為乳白色。

7.根據權利要求1所述的一種結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體的制備方法，其特征在于：根據上述結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體，于37℃條件下凝膠表面接種小鼠胚胎成纖維細胞，細胞數量隨γ-PGA-S72單體含量的增加而增加。并能夠在結合生長因子型溫敏水凝膠生物載體表面培養iPS細胞，使得iPS細胞能夠通過水凝膠的親疏水性自動脫附，從而避免了酶對細胞增殖和分化的影響。