[發明專利]一種基于釀酒酵母孢子的微膠囊固定化酶的制備方法

在審

• 申請號: 201410199661.1
• 申請日: 2014-05-12
• 公開（公告）號: CN103981171A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 中西秀樹;高曉冬;施李兵;李子杰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N11/16
• 分類號: C12N11/16;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/865
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種基于釀酒酵母孢子的微膠囊固定化酶的制備方法，屬于微生物和固定化酶技術領域。

背景技術

酵母菌泛指能發酵糖類的一大類單細胞真菌，最典型的酵母菌是釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)。釀酒酵母在良好的營養和生長條件下，生長迅速，以出芽繁殖的方式進行生殖。但以醋酸鹽為唯一或主要碳源，并輔以缺乏氮源等特定條件下，如只有乙酸鉀存在，釀酒酵母就會以孢子生殖的方式進行繁殖，在胞內形成孢子，此時的細胞即稱為子囊。子囊經自然或人為破壁后，可釋放出其中的子囊孢子。對于子囊孢子來說，其孢子壁由四層組成，從內到外依次為：甘露糖層，β-葡聚糖層，殼聚糖層和二酪氨酸層。

固定化酶能提高酶的穩定性，并且可以反復循環利用，在工業化生產方面優勢更加明顯。本發明基于釀酒酵母孢子的微膠囊固定化技術是一種新的固定化酶技術，通過分子生物學的方法使目的蛋白在酵母產孢過程中表達固定到孢子壁上殼聚糖層和二酪氨酸層之間的周質間隙，并保持相對獨立的空間結構和生物活性。這種獨特的空間定位使其相對于游離酶而言具有很多優良特性，如溫度(有機溶劑、蛋白酶)穩定性、重復使用性、無需蛋白純化和固定化操作、降低生產成本等。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于釀酒酵母孢子的微膠囊固定化酶的制備方法，是構建表達目的酶的重組釀酒酵母，培養重組釀酒酵母使其以孢子生殖的方式進行繁殖，在胞內形成孢子，目的酶表達定位在釀酒酵母孢子的殼聚糖層和二酪氨酸層之間的周質間隙，收集孢子獲得固定化酶。

所述酶是α-半乳糖苷酶、蔗糖酶或植酸酶。

所述表達定位通過信號肽引導酶表達在周質間隙。

所述方法包括以下步驟：

(1)將帶有自身信號肽的α-半乳糖苷酶基因MEL1(SEQ?ID?NO.1)融合插入到質粒pRS424-TEFpr，得到重組質粒pRS424-TEF_pr-MEL1；

所述α-半乳糖苷酶基因(MEL1)來源于酵母。

(2)將得到的重組質粒pRS424-TEF_pr-MEL1通過醋酸鋰/PEG的轉化方法轉化釀酒酵母，得到重組釀酒酵母；

(3)將重組釀酒酵母接種到SD-Trp培養基中，28℃～32℃培養，過夜；所述SD-Trp培養基成分為無氨基酸酵母氮源、去離子水，滅菌后，補加單獨滅菌的葡萄糖和不含色氨酸的氨基酸混合物；

(4)將步驟(3)中的菌液轉接到YPAce培養基中，28℃～32℃搖床12h～16h；所述YPAce培養基成分為酵母提取物、蛋白胨、腺嘌呤以及醋酸鉀；

(5)離心收集步驟(4)中的菌體，清洗，然后用1.5％～3％(m/v)醋酸鉀重懸，28℃～32℃搖床24h～48h；

(6)收集重組釀酒酵母細胞，用PBS溶液洗2～3次，然后再用PBS溶液重懸；

(7)向步驟(6)中的細胞懸浮液加入lyticase(溶壁酶)，冰上超聲；

(8)用PBS溶液將步驟(7)的破碎細胞洗2～3次，棄去上清得到釀酒酵母重組孢子；

(9)純化釀酒酵母重組孢子。

所述培養溫度優選30℃，醋酸鉀濃度優選2％。

所述步驟(9)中釀酒酵母重組孢子的純化：將得到的釀酒酵母重組孢子用Triton?X-100溶液洗滌，然后將孢子懸浮在Triton?X-100溶液中；配制不同濃度梯度的Percoll溶液；將不同濃度梯度的Percoll溶液按照從高濃度到低濃度依次加入到離心管中，最后加孢子懸浮液，離心后，溶液分層，純凈的孢子將會位于離心管的底部，將上層液體和細胞碎片除去，用PBS溶液洗滌孢子2～3次，冷凍干燥。

所述SD-Trp培養基優選無氨基酸酵母氮源與去離子水的質量百分比為0.67％，葡萄糖終濃度2％，氨基酸混合物終濃度0.67％。其中，氨基酸混合物粉末成分及比例如下：

所述YPAce培養基優選：2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％醋酸鉀，0.003％腺嘌呤。

本發明提供的固定化酶的制備方法只需要通過基因工程的方法對酶進行克隆、表達，必要的時候還可以對其進行基因改造優化；此外，作為固定化的載體細胞，釀酒酵母孢子，是一種可以廉價大規模培養的環保載體，與游離酶相比，該法制備的固定化酶可抵御不同水解酶的侵襲和耐受較高溫度，同時可以重復利用多次。

附圖說明