[發(fā)明專利]一種基于釀酒酵母孢子的微膠囊固定化酶的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410199661.1
• 申請日: 2014-05-12
• 公開（公告）號: CN103981171A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 中西秀樹;高曉冬;施李兵;李子杰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N11/16
• 分類號: C12N11/16;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/865
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種微膠囊固定化酶的制備方法，其特征在于，構(gòu)建表達目的酶的重組釀酒酵母，培養(yǎng)重組釀酒酵母使其以孢子生殖的方式進行繁殖，在胞內(nèi)形成孢子，目的酶表達定位在釀酒酵母孢子的殼聚糖層和二酪氨酸層之間的周質(zhì)間隙，收集孢子獲得固定化酶。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述酶是α-半乳糖苷酶，編碼所述α-半乳糖苷酶及其自身信號肽的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，酶在信號肽的引導下表達在周質(zhì)間隙。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述酶是蔗糖酶或植酸酶。

5.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將帶有自身信號肽的α-半乳糖苷酶基因插入到質(zhì)粒pRS424-TEFpr，得到重組質(zhì)粒pRS424-TEF_pr-MEL1；

(2)將得到的重組質(zhì)粒pRS424-TEF_pr-MEL1轉(zhuǎn)化釀酒酵母，得到重組釀酒酵母；

(3)將重組釀酒酵母接種到SD-Trp培養(yǎng)基中，28℃～32℃培養(yǎng)，過夜；

(4)將步驟(3)中的菌液轉(zhuǎn)接到Y(jié)PAce培養(yǎng)基中，28℃～32℃搖床12h～16h；

(5)離心收集步驟(4)中的菌體，清洗，然后用1.5％～3％醋酸鉀重懸，28℃～32℃搖床24h～48h，使釀酒酵母在胞內(nèi)形成孢子；

(6)收集、破碎重組釀酒酵母細胞，收集、純化獲得在孢子殼聚糖層和二酪氨酸層之間表達了α-半乳糖苷酶的孢子。

6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(6)收集重組釀酒酵母細胞，用PBS溶液洗2～3次，然后再用PBS溶液重懸；向細胞懸浮液加入Lyticase，冰上超聲；用PBS溶液將破碎細胞洗2～3次，棄去上清得到重組釀酒酵母孢子。

7.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，將收集得到的重組釀酒酵母孢子用Triton?X-100溶液洗滌，然后將孢子懸浮在Triton?X-100溶液中；利用Percoll分層液，離心獲得純的孢子，用PBS溶液洗滌孢子2～3次，冷凍干燥。

8.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述SD-Trp培養(yǎng)基成分為無氨基酸酵母氮源、去離子水，滅菌后，補加單獨滅菌的葡萄糖和不含色氨酸的氨基酸混合物。

9.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述YPAce培養(yǎng)基成分為酵母提取物、蛋白胨、腺嘌呤以及醋酸鉀。