[發(fā)明專利]一種具有抗凝血土元多肽及其酶解制備方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410199228.8
• 申請日: 2014-05-12
• 公開（公告）號: CN104004807B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設計）人: 吳暉;任堯;賴富饒;李曉鳳
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K4/12;C07K1/22;A61K38/17;A61P7/02;A23L33/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 何淑珍

技術領域

本發(fā)明涉及生物肽及其制備方法與應用，具體涉及一種具有抗凝血土元多肽及其酶解制備方法與應用。

背景技術

土元，又名地鱉(ground beetle)、土鱉蟲，系鱉蠊科昆蟲地鱉(Eupolyphaga sinesis Walker)或冀地鱉(Steleophage plancyi(Boleny))的雌蟲干燥體，是一種傳統中藥，臨床應用很廣泛，最早記載于秦漢著作《神農本草經》，具有散血瘀、接骨續(xù)筋、消腫止痛、下乳通經等功效。

土元傳統的入藥為原藥材粉碎直接服用或加熱水提、醇提后服用，其利用率低，且進入人體后帶來的活性不高。目前，有人從土元中提取單一的蛋白制成制劑，但制成的口服制劑經過胃腸道，容易被胃酶、胰酶酶解掉，活性大大降低；而制成注射液，大分子蛋白類又容易引起免疫原性，存在安全隱患。市面上已有治療帶狀皰疹的土元干粉，用以鎮(zhèn)痛，還尚未出現具有顯著抗凝血活性的土元功能性產品，因此開發(fā)出一種低成本、高活性的土元產品具有廣闊的市場經濟效益。

本發(fā)明采用可控酶解的方法，通過生物蛋白酶對土元軀體蛋白進行水解催化作用，把其中隱藏的抗凝血活性肽片段釋放出來，從而制備具有抗凝血活性的多肽。目前，對于生物活性肽的開發(fā)在國內外已成為熱點研究領域，多肽高活性、快吸收、安全健康的特點廣受產品開發(fā)者的青睞，目前已從可食蛋白中水解分離得到的有高F值寡肽、抗氧化肽、ACE抑制肽等，且多肽的開發(fā)所需儀器設備、生產條件簡單可行，所以，酶解土元蛋白制備抗凝血活性肽具有很高的可行性和廣闊的市場經濟效應。

經查閱已有專利，申請?zhí)枮椤?00810118148.X”的專利，其權利要求為一種土鱉蟲的仿生酶解產物及其用途，將土鱉蟲，加水勻漿，調節(jié)pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保溫酶解0.5～4小時，再調節(jié)pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保溫酶解2～8小時，即可得到產物。此專利中的發(fā)明主要采用胃蛋白酶和胰酶仿生酶解，制得用于治療心腦血管、腫瘤、跌打損傷等的混合多肽類物質，未進行進一步地分離純化，且對抗凝血活性的測定只用了PT單一指標。本專利采用高效的Alcalase2.4L堿性蛋白酶，酶解得到高水解度的活性多肽，并用DA201-C大孔吸附樹脂交換柱進行分離純化，采用ATPP、PT、TT、FIB四項指標對多肽的抗凝血活性進行比較，活性檢測更全面，所得多肽更純，具有一定疏水性，分子量更小，與上述專利得到的多肽群不同，故并不影響本專利的申請。

申請?zhí)枮椤?00610140160.1”和“200710046247.7”的專利，都是將土元干粉溶于水，加入模擬胃液進行酶解，酶解液過葡聚糖凝膠Sephadex G25層析柱，冷凍干燥，得多肽組分。此者主要采用模擬胃液將土元酶解，得到的酶解液經Sephadex G25柱分離后得到的產物體現出對帶狀皰疹的治療功效，后者提出了一定的鎮(zhèn)痛活性。本專利采用高效的Alcalase2.4L堿性蛋白酶，酶解得到高水解度的活性多肽，過DA201-C大孔吸附樹脂柱，得到的多肽產物表現出抗凝血活性，與上述專利得到的多肽群不同，并不影響本專利的申請。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗凝血土元多肽及其酶解制備方法與應用。本發(fā)明方法能夠實現原料的高效利用，具有高活性、高安全、簡單可控、環(huán)境溫和的制備特點。

本發(fā)明的目的由以下方案實現：

(1)取土元洗凈干燥，粉碎成細粉；加水溶解，細粉與水的比例為10～20g：100mL，pH調至8.0～11.0，以100～400r/min的速度均勻攪拌0.5h～4h以加速溶解，取上清液調pH至2～6，制得土元蛋白，再將pH調至4～8，干燥；(2)將步驟(1)得到的蛋白加水溶解，比例為5～20g：100mL，控制pH值在7.5～10，再加入堿性蛋白酶為生物催化劑，反應溫度為30～70℃，以100～300r/min勻速攪拌1～4h；煮沸5～30min，滅酶活，結束反應；5000～10000r/min離心，收集上清液，干燥，得到粗多肽粉末。

(3)裝柱：根據層析柱體積稱取適量DA201-C大孔吸附樹脂進行預處理后，裝柱，層析柱規(guī)格2.6×60cm，待穩(wěn)定后，用3倍柱體積純凈水(條件與洗脫時的相同)沖柱。