[發明專利]一種水蛭高F值寡肽及其酶解制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410198756.1
• 申請日: 2014-05-12
• 公開（公告）號: CN104004087A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 吳暉;任堯;賴富饒;楊祎靜;李曉鳳
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C07K14/815
• 分類號: C07K14/815;C12P21/06;A23L1/29;C07K1/18
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

技術領域

本發明涉及生物肽及其制備方法與應用，具體涉及一種水蛭高F值寡肽及其酶解制備方法與應用。

背景技術

高F值寡肽是一種支鏈氨基酸和芳香族氨基酸摩爾數比值大于20的生物活性寡肽混合物。它不僅能減輕肝性腦病癥狀、改善肝功能和肝昏迷程度，還對蛋白質營養失常患者有積極作用。在實際生產中，高F值寡肽可以廣泛應用在治療肝臟疾病的藥品、護肝食品、外科手術病人的蛋白營養食品、消化酶缺乏患者的腸道營養劑和高強度勞動者的食品營養強化劑等方面。高F寡肽混合物較支鏈氨基酸配方更具有實際效用，其獨特生理功能已受到多方人士的高度關注，具有良好的發展前景。

水蛭俗稱螞蝗，是中國傳統的藥用水生動物，具有治療中風、淤血腫痛、高血壓、閉經等疾病的功效，其中以寬體金線蛭最為常見。寬體金線蛭(Whitmania?Pigra)，隸屬于真蛭亞綱(Euhirdinea)、無吻蛭目(Arhynchobdelliada)、黃蛭科(Haemopidae)、金線蛭屬(Whimania)，《中國藥典》2010年版中記載為“螞蝗W.pigra?Whitman”，廣泛分布于我國大部分地區的湖泊、池塘及水田，其干體的蛋白含量在70％～80％之間，是目前我國中藥材市場中主流的水蛭品種。國內中藥材市場上的主流藥用水蛭品種。好幾個世紀以前，人類就已經成功利用水蛭進行相關疾病預防和治療，但是，隨著醫療技術的不斷發展，能起相同療效的藥物如阿司匹林、硝酸甘油等的相繼出現，水蛭的作用漸漸被被世人所遺忘。目前，市面上的水蛭產品主要以抗凝血、抗血栓為主，產品種類較為單一，因此探索水蛭更豐富的應用潛能，開發一種方法簡便、成本較低、容易吸收的水蛭高F值寡肽具有一定的市場價值。本發明以水蛭干粉作為原料，利用酶工程技術和現代分離純化技術，生產一種純天然、易吸收的高F值生物活性寡肽混合物，這一研究為寬體金線蛭資源的合理運用開發提供依據，為進一步提高其附加值提供重要的運用途徑。

發明內容

本發明的目的在于提供一種水蛭高F值寡肽及其酶解制備方法與應用。本方法所采用的堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶為商業用酶，價格相對低廉，易于實現工業化。

本發明的目的由以下方案實現：

(1)將水蛭干燥體用清水洗凈，并于去離子水中浸泡8～24h，再于分析純乙醇中浸泡8～24h，干燥粉碎，得到水蛭干粉，置于-4～-20℃冷藏備用；

(2)稱步驟(1)得到的水蛭干粉，加水溶解，按干粉與水重量比為1～8：100配制懸濁液，調整pH至8～11，浸泡10～60min，再調節pH至7.5～11，加入堿性蛋白酶，反應溫度保持在30～80℃，酶解1～6h；煮沸5～30min，滅酶活，冷卻，4000～10000r/min離心5～20min，收集上清液，調節pH至7～10，加入木瓜蛋白酶，反應溫度保持在25～80℃，酶解1～6h；煮沸5～30min，滅酶活，冷卻，4000～10000r/min離心5～20min，收集上清液，調整pH至2～7，按活性炭重量與上清液體積比0.2～20g：100mL加入活性炭，在25～60℃下吸附30～100min，4000～10000r/min離心5～30min，收集上清液；

(3)裝柱：根據層析柱體積稱量適量Sephadex?G-15凝膠填料進行溶脹處理，排除破碎顆粒，按照1.6×120cm的規格填層析柱，以去離子水沖柱穩定；

(4)Sephadex?G-15凝膠過濾：加入經活性炭靜態吸附的酶解液，以去離子水洗脫，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脫液，富集濃縮，冷凍干燥，得到水蛭高F值寡肽粉。

優選地，所述的水蛭為寬體金線蛭Whitmania?Pigra。

優選地，步驟(1)和步驟(2)中所述pH調至以8～11，調節pH至7.5～11，調節pH至7～10具體為：用0.1-2mol/L?NaOH將pH調至所述pH值；所述收集上清液，調整pH至2～7具體為：用0.1-2mol/L的HCl將pH調至2～7。

優選地，所添加的堿性蛋白酶為Alcalase2.4L，酶活力3.9323×10⁵U/mL，所添加的木瓜蛋白酶為Papain，酶活力0.8231×10⁵U/g。

優選地，所述堿性蛋白酶添加量為4000～15000U/g?pro，優選6000～13000U/g?pro；所述木瓜蛋白酶添加量為按2000～10000U/g?pro，優選2000～8000U/g?pro。