[發(fā)明專(zhuān)利]一種試劑及其在硫化氫檢測(cè)中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410194129.0
• 申請(qǐng)日: 2014-05-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103937491A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 霍方俊;陰彩霞
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C09K11/06
• 分類(lèi)號(hào): C09K11/06;C07D493/10;G01N21/64
• 代理公司: 山西五維專(zhuān)利事務(wù)所(有限公司) 14105
• 代理人: 張福增

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及硫化氫的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種試劑及其合成方法，以及這種試劑在檢測(cè)硫化氫中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

硫化氫具有臭雞蛋味一直被視為環(huán)境有毒氣體。然而，最近的研究表明H₂S是除了兩種眾所周知的氣體信號(hào)傳送器一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)外的第三種具有細(xì)胞保護(hù)作用的內(nèi)源性氣體信號(hào)化合物。硫化氫在許多病癥中具有保護(hù)作用：如血管生成、血管舒張、細(xì)胞凋亡、炎癥調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)制等。另一方面，細(xì)胞中異常硫化氫水平能引起許多疾病如阿爾茨海默氏病、唐氏綜合征、糖尿病、肝硬化。這些新興的生物學(xué)作用的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致人們對(duì)H₂S的研究興趣與日俱增。因此，要求發(fā)展快速、準(zhǔn)確、可靠的方法來(lái)檢測(cè)H₂S，以便為更好地理解它的生物學(xué)功能提供有用的信息。近年來(lái)，一些儀器的分析技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到檢測(cè)各種環(huán)境，醫(yī)療和細(xì)胞中的H₂S。事實(shí)上，基于熒光的測(cè)定法，因?yàn)榘l(fā)射信號(hào)的快速、非破壞性、選擇性、敏感的優(yōu)點(diǎn)在活細(xì)胞，組織和生物體的各種分析物的熒光成像上有廣泛的用途。在本發(fā)明中我們合成了一種新的化合物，5-曡氮熒光素醌，通過(guò)H₂S將曡氮還原為胺基，化合物的熒光性質(zhì)在反應(yīng)前后的變化實(shí)現(xiàn)了硫化氫的快速檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種選擇性高、水溶性好的定量檢測(cè)硫化氫的試劑，以及該試劑在硫化氫檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的快速檢測(cè)硫化氫的試劑和方法，是基于一種5-曡氮熒光素醌，在pH為7.4的HEPES溶液和乙腈混合溶液中定量地檢測(cè)硫化氫的含量。該檢測(cè)方法，對(duì)硫化氫顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便、靈敏、快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

該試劑的結(jié)構(gòu)式是：

該試劑的合成方法，步驟為：將5-氨基熒光素溶解在體積比2:1的醋酸和H₂O的混合溶液中，冷卻到0℃，然后加入NaNO₂攪拌15分鐘，再加入NaN₃，在0℃反應(yīng)1小時(shí)，升溫到室溫再反應(yīng)1小時(shí)，懸浮液真空抽濾，固體用鹽酸和水洗滌，真空干燥后，得到黃色的5-曡氮熒光素醌固體；5-氨基熒光素、NaNO₂和NaN₃的摩爾比1:1.5:1.5。

用該試劑檢測(cè)硫化氫的方法，步驟為：

(1)、配制pH＝7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，配制2mM的5-曡氮熒光素醌的乙腈溶液；

(2)、按體積比1000:1000:1，將HEPES緩沖溶液、乙腈溶液和5-曡氮熒光素醌的乙腈溶液加到干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測(cè)，隨著待測(cè)樣的加入,531nm的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；

(3)、用蒸餾水配制2mM的硫化氫溶液；把1mL的HEPES緩沖溶液、1mL的乙腈溶液1μL的5-曡氮熒光素醌乙腈溶液加到另一個(gè)熒光比色皿中，分別在加入硫化氫溶液的體積為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μL時(shí)，在熒光分光光度儀上測(cè)定531nm對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度F為95、175、273、382、467、539、643、717、802、883，以硫化氫濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)熒光強(qiáng)度F－F₀為縱坐標(biāo)繪制圖，F(xiàn)₀﹦17，得到硫化氫濃度的工作曲線；線性回歸方程為：F－F₀＝-3.14+440c，c的單位為μM；

(4)、將HEPES緩沖溶液1000uL、乙腈溶液1000μL和5-曡氮熒光素醌乙腈溶液1uL加到干凈的熒光比色皿中，用微量進(jìn)樣器吸取VμL待測(cè)樣品溶液，加入到此干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測(cè)，將測(cè)得的熒光強(qiáng)度代入(3)的線性回歸方程，得到濃度c，待測(cè)樣品C_{待測(cè)樣}＝(2000+V_{待測(cè)樣})μL×c×10^-6/VμL,即可求得硫化氫的濃度。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：1、合成了一種新型的醌類(lèi)化合物；2、本發(fā)明的檢測(cè)方法，對(duì)硫化氫顯示了高的靈敏性和選擇性；3、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單，只需要借助熒光分光光度儀即可實(shí)現(xiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1a實(shí)施例1制備得到的試劑的核磁¹HNMR圖譜

圖1b實(shí)施例1制備得到的試劑的核磁¹³CNMR圖譜

圖1c實(shí)施例1制備得到的試劑的質(zhì)譜圖

圖2實(shí)施例2試劑與硫化氫作用的熒光發(fā)射圖