[發明專利]一種表達豬端粒酶反轉酶轉座子載體及其構建方法與在建立豬永生化細胞系中的應用

有效

• 申請號: 201410193534.0
• 申請日: 2014-05-08
• 公開（公告）號: CN103923942A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 孫懷昌;何姍;張鑫宇;夏曉莉
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及生物技術研究領域，具體涉及一種表達豬端粒酶反轉錄酶轉座子載體的構建及其在建立豬永生化細胞系中的應用。?

背景技術

正常組織來源的原代細胞可在體外培養條件生長和分裂，但不僅來源有限、制備困難，而且反復傳代后就會發生衰老和死亡，使得細胞培養技術的應用受到限制。細胞系可以克服原代細胞的缺點，也是細胞生物學特性研究、病毒分離培養和疫苗生產必不可少的工具，但目前國內外豬細胞系種類極為有限。?

細胞永生化是指體外培養的細胞在自發突變或環境因素影響下從衰老危機中逃離，從而獲得無限增殖能力的過程，但動物細胞自發永生化的幾率很低，人細胞自發永生化更為罕見。將外源永生化基因導入細胞，可以增加細胞永生化的幾率，進而建立永生化細胞株。常用的細胞永生化基因主要有EB病毒、SV40病毒、人乳頭瘤病毒的細胞轉化基因，Myc等原癌基因，以及抑癌基因突變體等；常用的基因導入方法主要有電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質體轉染法以及重組逆轉錄病毒、腺病毒、慢病毒轉導法等。然而，上述方法導入的外源基因與細胞基因組整合是隨機的，基因插入及其表達產物有可能干擾細胞的正常生理功能，如失去分化能力和改變分化特性等。另外，上述方法獲得的轉化細胞不是正常細胞，其表型和核型等有可能發生變化，而且建立的細胞系多不具有無限增殖能力，有的僅度過了M1期而延長了細胞的壽命。?

端粒和端粒酶的發現為細胞永生化提供了新的思路。端粒是真核細胞染色體末端的特殊結構，對維持細胞染色體穩定和完全復制具有重要作用。正常體細胞的端粒隨細胞分裂而逐漸縮短，最終導致細胞衰老和死亡，因此端粒長度與細胞壽命密切相關。端粒酶是一種特殊的逆轉錄酶，能以自身RNA為模板合成和延伸端粒DNA，以補償細胞分裂導致的染色體縮短。端粒酶由端粒酶RNA、相關蛋白和反轉錄酶(TERT)三部分組成，但正常情況下成年體細胞的端粒酶活性處于抑制狀態，而外源TERT基因導入能穩定原代細胞的端粒長度和使細胞永生化。與傳統的永生化基因轉染相比，用端粒酶基因轉染產生的永生化細胞是正常細胞而非轉化細胞，仍然保持正常細胞的生長速率、核型、接觸生長抑制性、血清依賴性等生理特性，而且不具有致癌性和軟瓊脂克隆形成能力。另外，TERT介導的永生化細胞已度過了M期，與胚胎細胞一樣是真正意義上的永生化細胞，有的能在體外傳100代以上。?

目前普遍用于動物細胞永生化的是人源TERT基因，對動物細胞是外源基因，其永生化效率也可能有別于動物源TERT。另外，基因導入方法主要有表達質粒轉染法和重組病毒轉導法，前者含抗性基因且需要長時間篩選，后者多不能有效整合外源基因，逆轉錄病毒和慢病毒雖能介導外源基因整合，但基因整合不僅是隨機的，而且插入的病毒序列存在生物安全隱患。本發明用豬蛋白翻譯延伸因子1a(EF-1a)啟動?子，以豬TERT?cDNA為永生化基因，用轉座子介導永生化基因整合，建立的永生化細胞系不僅能維持正常細胞生理功能，而且不含抗性基因、病毒序列和癌基因，可用于豬細胞生物學特性研究、病毒分離培養和疫苗生產。?

發明內容

本發明的轉座子載體由SB轉座子重復序列、豬EF-1a啟動子、豬TERT?cDNA和生長激素基因polyA序列組成，經與轉座酶載體共轉染細胞證明，該載體能有效介導豬TERT基因與細胞基因組的整合和穩定表達。?

本發明所述轉座子載體用下列方法構建：?

(1)用聚合酶鏈式反應擴增豬EF-1a啟動子和生長激素基因polyA序列，插入SB轉座子載體pT2/HB，獲得穩定表達載體pTEG；?

(2)用反轉錄PCR擴增豬TERT?cDNA，插入pTEG載體獲得重組載體pTEG-TERT。?

其中步驟(1)是：用豬EF-1a啟動子驅動永生化基因穩定表達；步驟(2)是：以豬TERT?cDNA作為豬源細胞的永生化基因，以SB轉座子介導永生化基因整合。?

本發明還公開了所述的表達豬端粒酶反轉酶的轉座子載體在豬永生化細胞系建立中的應用。其具體方法如下：?

(1)用轉座子載體pTEG-TERT和轉座酶載體pSB16共轉染豬原代細胞，用有限稀釋法獲得單細胞克隆；?

(2)用PCR分別檢測細胞克隆的抗性基因和豬TERT基因表達盒，排除重組載體隨機整合的細胞克隆，保留轉座子介導豬TERT基因表達盒整合的細胞克隆；?

(3)對目的細胞克隆進行反復傳代，獲得永生化細胞系。?