[發(fā)明專利]一種表達豬端粒酶反轉酶轉座子載體及其構建方法與在建立豬永生化細胞系中的應用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410193534.0 | 申請日： | 2014-05-08 |
| 公開（公告）號： | CN103923942A | 公開（公告）日： | 2014-07-16 |
| 發(fā)明（設計）人： | 孫懷昌;何姍;張鑫宇;夏曉莉 | 申請（專利權）人： | 揚州大學 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10 |
| 代理公司： | 南京知識律師事務所 32207 | 代理人： | 盧亞麗 |
| 地址： | 225009 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 表達 端粒 反轉 座子 載體 及其 構建 方法 建立 永生 細胞系 中的 應用 | ||
1.一種表達豬端粒酶反轉酶的轉座子載體，是由SB轉座子重復序列IR/DR、豬蛋白翻譯延伸因子1a(EF-1a)啟動子、豬端粒酶反轉酶(TERT)cDNA和生長激素基因polyA序列組成。
2.權利要求1所述的表達豬端粒酶反轉酶的轉座子載體在豬永生化細胞系建立中的應用。
3.權利要求1所述的表達豬TERT轉座子載體的構建方法，其步驟如下：
(1)用聚合酶鏈式反應擴增豬EF-1a啟動子和生長激素基因polyA序列，插入SB轉座子載體pT2/HB，獲得穩(wěn)定表達載體pTEG；
(2)用反轉錄PCR擴增豬TERT?cDNA，插入pTEG載體獲得重組載體pTEG-TERT。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟(1)是：用豬EF-1a啟動子驅動永生化基因穩(wěn)定表達；步驟(2)是：以豬TERT?cDNA作為豬源細胞的永生化基因，以SB轉座子介導永生化基因整合。
5.權利要求2所述的表達豬TERT轉座子載體在豬永生化細胞系建立中的應用，其具體方法如下：
(1)用轉座子載體pTEG-TERT和轉座酶載體pSB16共轉染豬原代細胞，用有限稀釋法獲得單細胞克隆；
(2)用PCR分別檢測細胞克隆的抗性基因和豬TERT基因表達盒，排除重組載體隨機整合的細胞克隆，保留轉座子介導豬TERT基因表達盒整合的細胞克隆；
(3)對目的細胞克隆進行反復傳代，獲得永生化細胞系。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟(1)是：豬TERT永生化的細胞為非轉化正常細胞；步驟(2)是：篩選的細胞克隆不含抗性基因和病毒序列。
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