[發明專利]一種從大豆乳清廢水中提純Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的方法

有效

• 申請號: 201410193480.8
• 申請日: 2014-05-09
• 公開（公告）號: CN103965352A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 華欲飛;李興飛;孔祥珍;陳業明;張彩猛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/32
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及大豆乳清蛋白的回收方法，具體是指一種利用聚陽離子多糖回收大豆乳清中的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的方法，屬于農產品加工及副產品綜合利用技術領域。

背景技術

大豆乳清蛋白是殘存于大豆乳清中不能為酸所沉淀的蛋白質，在大豆乳清蛋白中2S組分所占的比重較大；乳清蛋白質中除含有球蛋白、白蛋白之外，還含有：①Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI，pH3.0~10.0，20kDa)；②Bowman-Brik胰蛋白酶抑制劑(BBI，pH3.0~10.0，20KDa)；③β-淀粉酶(61.7KDa)；④凝集素（pH2.2~10.8，120KDa）；⑤脂氧合酶（LOX，102KDa）；⑥磷酸酶；⑦植酸酶和⑧細胞色素C等很多種生理活性物質，約占大豆蛋白的9%-15.3%。

目前，大豆胰蛋白酶抑制劑抗營養作用主要表現在抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白質消化吸收和造成胰腺腫大兩個方面。主要是胰蛋白酶抑制因子與小腸液中胰蛋白酶、糜蛋白酶結合，生成無活性復合物，消耗和降解胰蛋白酶，導致腸道對蛋白質消化、吸收及利用能力下降。同時，胰蛋白酶抑制劑與腸內胰蛋白酶結合后隨糞便排出體外，使腸內胰蛋白酶數量減少。然而，營養過度和營養不平衡將導致癌癥、高血壓、肥胖癥等疾病。這些被認為影響人類消化吸收的具有生物活性的大豆乳清蛋白，現在對預防治療某些疾病具有顯著效果，這使得大豆乳清廢水成為一種有效的原料來源。例如，低濃度的胰蛋白酶抑制劑是廣譜抗致癌因子，能預防結腸癌、肝癌、口腔癌、肺癌等多種癌癥的發生，還有降低膽固醇水平的作用；能增強胰臟生長和增加胰消化酶的活性，且對動物內皮細胞生長因子具有活化作用；能控制腎小球腎炎或腎盂腎炎的一些炎癥發展過程。此外，微量胰蛋白酶抑制劑對于糖尿病治療，調節胰島素失調有一定效果。醫藥上提取胰蛋白酶抑制劑(抑肽酶) 治療急性胰腺炎。

已有大量文獻報道了乳清蛋白的回收方法。例如CN1537865公開的從大豆黃漿水提取乳清蛋白、核酸等成分；CN1954689和CN1364765公開的膜分離制備和提取大豆乳清蛋白的方法。CN102746375公開的一種具有抗腫瘤作用的大豆乳清蛋白的制備方法。CN1027812公開了從乳清工藝流中回收和分離大豆乳清蛋白和其它組分的方法。這些方法均采用了膜分離或者離子交換層析方法。本發明采用了天然可食性的聚陽離子多糖作為回收材料，充分利用了蛋白多糖的復凝聚原料，有針對性的回收了大豆乳清蛋白中的KTI，本工藝流程用于選擇性回收乳清蛋白未見報道。本發明不僅可以去除大豆乳清中的KTI組分，降低大豆乳清的抗營養成分，還可以回收高純度的KTI。

發明內容

本發明的目的是提供一種簡單易于操作的實驗室規模制備高純度KTI的方法，制備的KTI純度達到90%，仍然保持天然的KTI活性。

本發明的技術方案，一種從大豆乳清廢水中提純Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的方法，步驟為：

（1）大豆乳清廢水的預處理：將大豆乳清廢水用pH調節劑調節至pH4.5，離心，除沉淀；再次pH調節劑調節pH至7.0-10.0，離心，除沉淀，收集上清液；將上述上清液經過截留分子量3500-8000Da的透析膜透析，脫鹽36-48h，即得大豆乳清液；

（2）大豆乳清液與聚陽離子多糖復凝聚：將步驟（1）制備的大豆乳清液用去離子水稀釋1-4倍，使其中大豆乳清蛋白的質量濃度為0.1%-0.4%，得大豆蛋白乳清液；將上述大豆蛋白乳清液與質量濃度為0.1%-0.4%的聚陽離子多糖溶液按照體積比為100-200︰1混合，pH調節劑調節pH至4.0-6.0，離心，收集沉淀；對上清液重復以上步驟2-3次，合并沉淀物，即得Kunitz型胰蛋白酶抑制劑與聚陽離子多糖的復合物；

（3）純化Kunitz型胰蛋白酶抑制劑：將步驟（2）得到的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑與聚陽離子多糖的復合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，pH調節劑調節pH至8.0-11.0，離心，棄去沉淀物，收集上清液，真空冷凍干燥，即得純化的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。

所述pH調節劑為：酸性pH調節劑選用:有機酸：包括但不限于甲酸、乙酸；無機酸：包括但不限于鹽酸，硫酸；堿性pH調節劑選用：包括但不限于氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉。

所述步驟（3）中，純化的KTI經過SEC-HPLC檢測樣品純度，經過雙縮脲法測定蛋白含量，經過苯酚硫酸法測定含糖量，經過干燥法測定水分，經過灼燒重量法測定灰分；KTI回收完成后，剩余的大豆乳清液經過電泳（SDS-PAGE）分析確定KTI殘余量。