[發(fā)明專利]一種高效增殖、靶向殺傷腫瘤的CTL制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410192581.3
• 申請(qǐng)日: 2014-05-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103923880A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏薇;趙西娟;魏麗婉;孟祥玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都百賽泰科生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 成都行之專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51220
• 代理人: 譚新民

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞的培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地，涉及一種高效增殖、靶向殺傷腫瘤的CTL制備方法。

背景技術(shù)

目前，腫瘤已成為威脅人類生命和健康的首要敵人，其發(fā)病率也在逐年上升，《世界癌癥報(bào)告》顯示全球癌癥病例由2012年的1400萬(wàn)人，逐年遞增至2025年的1900萬(wàn)人，到2035年將達(dá)到2400萬(wàn)人；每年死于癌癥的人數(shù)不斷增加，由820萬(wàn)人增加至1300萬(wàn)人，到2030年新增癌癥病例將增加50%，達(dá)到每年2160萬(wàn)人。癌癥是中國(guó)居民死亡的主要原因之一，根據(jù)我國(guó)腫瘤發(fā)病情況登記年報(bào)顯示，每年新發(fā)腫瘤病例約為350萬(wàn)例，全國(guó)每分鐘有6人被診斷為癌癥，約有250萬(wàn)人死于癌癥。預(yù)計(jì)，到2020年，新發(fā)病例將達(dá)到390萬(wàn)，因惡性腫瘤而死亡的人數(shù)將達(dá)294萬(wàn)。手術(shù)、放療和化療是治療腫瘤的三大常規(guī)方式，能在短時(shí)間內(nèi)有效減輕腫瘤負(fù)荷，但因其不能有效清除腫瘤細(xì)胞，手術(shù)后微小殘存病灶、對(duì)化療產(chǎn)生耐藥及對(duì)放療不敏感的患者腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且副作用大等弊端，使得腫瘤的臨床療效低。腫瘤細(xì)胞免疫治療作為一種全新的腫瘤全身治療方式，能系統(tǒng)殺滅腫瘤細(xì)胞，有效抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，副反應(yīng)小等良好的臨床治療效果，克服了腫瘤傳統(tǒng)治療方式的“不徹底、易轉(zhuǎn)移、副作用大”等弊端，是目前國(guó)際上公認(rèn)的繼手術(shù)、放療和化療之后最有希望完全消滅腫瘤細(xì)胞的第四大治療腫瘤的新技術(shù)。

目前，腫瘤細(xì)胞免疫治療應(yīng)用于臨床的細(xì)胞有DC細(xì)胞（樹(shù)突狀細(xì)胞）、CIK細(xì)胞（細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞）、DC-CIK細(xì)胞和CTL細(xì)胞，其中CTL（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）因具有腫瘤特異性，能直接靶向作用于腫瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性高等特點(diǎn)，而成為目前臨床研究的熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞免疫治療在臨床上取得了不錯(cuò)的療效，特別是，2010年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了Dendreon公司的前列腺癌疫苗Provenge（商品名：sipuleucel-T）的上市申請(qǐng)，成為第一支通過(guò)FDA批準(zhǔn)的DC疫苗，也是近20年以來(lái)腫瘤生物治療領(lǐng)域的重大突破，推動(dòng)了腫瘤細(xì)胞免疫治療在臨床治療惡性腫瘤中的應(yīng)用。然而，經(jīng)體外擴(kuò)增回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的有效的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量較少，能有效作用于腫瘤靶細(xì)胞的效率較低，因而限制了腫瘤治療的效果，不能顯著的提高腫瘤患者尤其是晚期患者的生存期。另一方面，腫瘤患者的免疫應(yīng)答能力很弱，CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）也抑制對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此腫瘤患者的免疫系統(tǒng)不能對(duì)腫瘤起到有效的殺傷作用，即產(chǎn)生機(jī)體對(duì)腫瘤耐受。同時(shí)，腫瘤微環(huán)境通過(guò)多種途徑促使Treg細(xì)胞的數(shù)量增加，即釋放趨化因子CCL22，將胸腺、骨髓、淋巴結(jié)以及外周血中自然產(chǎn)生的Treg趨化至腫瘤局部；產(chǎn)生的VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）、TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1）、IL-10（白細(xì)胞介素-10）能誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生及對(duì)胸腺來(lái)源的天然Treg具有擴(kuò)增作用；并且抑制性分子TGF-β、COX-2（環(huán)氧化酶-2）、CD70、Galectin-1（半乳糖凝集素-1）、IDO（吲哚胺2,3-雙加氧酶）能使CD4⁺CD25⁺Treg轉(zhuǎn)化為CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Treg，導(dǎo)致腫瘤患者的自身免疫系統(tǒng)不能辨認(rèn)和清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，加劇腫瘤的免疫耐受，使腫瘤無(wú)限制生長(zhǎng)。由于腫瘤的免疫耐受，使得回輸?shù)男?yīng)細(xì)胞不能在體內(nèi)引起有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)，影響了效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。

天然Treg是一個(gè)具有免疫調(diào)節(jié)作用的T淋巴細(xì)胞亞群，約占CD4⁺T細(xì)胞的5%-10%，起著維持機(jī)體自身免疫耐受的作用。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，各種腫瘤患者體內(nèi)的?Treg數(shù)量比正常人明顯增多，因此腫瘤患者機(jī)體處于一個(gè)高度免疫耐受的狀態(tài)。所以，體外采集腫瘤病人外周血單核細(xì)胞（PBMC）時(shí)，Treg細(xì)胞比例高，同時(shí)在誘導(dǎo)擴(kuò)增效應(yīng)細(xì)胞所用的IL-2也能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖，且能分泌大量IL-10，由此抑制效應(yīng)細(xì)胞的增殖、降低其細(xì)胞殺傷活性。

因此，如何提高效應(yīng)細(xì)胞的增殖效率及靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，打破腫瘤免疫耐受，抑制培養(yǎng)過(guò)程中Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化數(shù)量，提高細(xì)胞免疫治療的療效是目前腫瘤細(xì)胞免疫治療技術(shù)亟需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種體外CTL細(xì)胞的制備方法，該方法能夠顯著提高體外CTL細(xì)胞增殖的效率及其靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，抑制腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞向CD4⁺CD25⁺Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化。