[發(fā)明專利]一種高效增殖、靶向殺傷腫瘤的CTL制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410192581.3
• 申請日: 2014-05-08
• 公開（公告）號(hào): CN103923880A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏薇;趙西娟;魏麗婉;孟祥玲
• 申請（專利權(quán)）人: 成都百賽泰科生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 成都行之專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51220
• 代理人: 譚新民

1.一種高效增殖、靶向殺傷腫瘤的CTL制備方法，包括以下步驟：

（a）去除CD4⁺CD25⁺Treg細(xì)胞：采集并分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，通過免疫磁珠陰性分選法去除CD4⁺CD25⁺Treg細(xì)胞，得到CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺的混合細(xì)胞；

（b）分離T淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞：將得到的混合細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置孵育，獲得T淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞，

（c）成熟DC細(xì)胞的制備：將T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中；貼壁的DC細(xì)胞中加入含有GM-CSF及IL-4的無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)5天；第6天，加入腫瘤細(xì)胞全抗原，第7天得到負(fù)載腫瘤細(xì)胞全抗原的DC細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中加入TNF-α和IL-27，得到成熟的DC細(xì)胞；

（d）CIK的制備：將T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至經(jīng)抗CD3單克隆抗體和重組人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，并在無血清培養(yǎng)基中加入IFN-γ，置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2天在培養(yǎng)基中加入IL-2、IL-12、IL-27，培養(yǎng)至第8天，得到CIK細(xì)胞；

（e）CTL細(xì)胞的制備：將上述（d）步驟得到的CIK細(xì)胞與（c）步驟得到的成熟DC細(xì)胞，在含有IL-12、IL-7、抗CD28單克隆抗體的無血清培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)；混合培養(yǎng)的第3天，在培養(yǎng)基中加入抗CTLA-4單克隆抗體，繼續(xù)培養(yǎng)4天即可得到CTL細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CTL制備方法，其特征在于，所述（b）分離T淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞步驟中，所述無血清培養(yǎng)基為20-40ml的無血清AIM-Ⅴ培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CTL制備方法，其特征在于，所述（c）成熟DC細(xì)胞的制備步驟中，GM-CSF為50ng/ml、IL-4為25ng/ml、腫瘤細(xì)胞全抗原為50μg/ml、TNF-α為30ng/ml、?IL-27為10-30ng/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CTL制備方法，其特征在于，所述（d）CIK的制備步驟中，抗CD3單克隆抗體為50ng/ml、重組人纖維連接蛋白為1μg/ml、所述無血清培養(yǎng)基為20-40ml無血清AIM-Ⅴ培養(yǎng)基、IFN-γ為1000U/ml、IL-2為20ng/ml、IL-12為5-15ng/ml、IL-27為5-20ng/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CTL制備方法，其特征在于，所述（e）CTL細(xì)胞的制備步驟中，CIK細(xì)胞和成熟DC細(xì)胞的混合比例為10：1、IL-12為5ng/ml、IL-7為5-15ng/ml、抗CD28單克隆抗體為50ng/ml、所述無血清培養(yǎng)基為20ml無血清AIM-Ⅴ培養(yǎng)基、CTLA-4單克隆抗體為50ng/ml-1μg/ml。