[發明專利]基于核酸等溫擴增基因跳躍復制擴增法

無效

• 申請號: 201410191895.1
• 申請日: 2014-05-08
• 公開（公告）號: CN103966200A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 曲海濤;張文超
• 申請（專利權）人: 哈爾濱德歌生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
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技術領域

本創新發明涉及全新的核酸等溫擴增法，在Bst DNA 聚合酶作用下基于核酸等溫擴增基因跳躍復制擴增法，可用于細菌、病毒等各種基因的檢測領域，此方法不僅可以應用于核酸定性、定量檢測等，未來還可能應用新基因的合成，從而應用于醫藥。

背景技術

一直以來，病原微生物的體外培養是病原體診斷的“金標準”。據微生物學家的估計，采用目前的培養技術，僅有約1%的細菌可以培養。在過去的一個世紀里，以聚合酶鏈反應（PCR）為代表的基于核酸的檢測技術發展迅速，為其他病原體的精確檢測診斷提供了可能。毋庸置疑，Kary Mtlllis發明的PCR技術是20世紀80年代分子生物學領域的一項革命性突破。也許他本人當時也沒有想到，PCR技術會在分子生物學、醫學、法學等領域發揮如此重要的作用。經過幾十年的改進，PCR方法已從定性發展為定量，能夠在幾個小時內，從幾個拷貝或單個細胞開始擴增到數十億特異性的核酸片段，而且特異性也有了極大的提高。然而，從PCR技術的誕生之日起，它始終無法擺脫依賴精良儀器設備的局限，使得以PCR為基礎的核酸擴增檢測技術無法更廣泛地推廣和應用。

基于這種強烈的需求，以核酸等溫擴增技術為基礎的檢測技術近年來得到了迅猛的發展。多種機制的等溫技術不僅誕生，而且有些技術已經相當成熟，完成了從實驗室到實際應用的過渡，正逐步在分子生物學、醫學、法學等領域得到廣泛運用。特別是在臨床和現場（point－of－care）快速診斷技術方面，核酸等溫擴增技術顯示了其突出的優越性。更為重要的是，核酸等溫擴增技術由于不需要溫度變化的時間過程且擺脫了對精良儀器設備的依賴，使得我們對病原體的檢測診斷得以快速并高通量的實現。

90年代未核酸等溫擴增技術不斷涌現發展，包括核酸序列的擴增技術（NASBA），自動維持序列擴增（3SR）、鏈置換擴增技術（SDA）以及環介導等溫擴增技術?，F有最主要的等溫擴增技術就是環介導等溫擴增（可參見其相關專利ZL 00818262.0，ZL01810370.7，ZL01812204.3，ZL02815992.6，ZL200610080379.7），它效率較高，但引物結構較復雜。

發明內容

一種基于核酸等溫擴增基因跳躍復制擴增法，所設計的不同引物在Bst DNA聚合酶作用下，可以在等溫條件下高特異性、高效和快速地完成DNA擴增。其特征在于：基因可以通過跳躍復制完成擴增，從而提高了基因擴增的反應效率，引物與目標DNA結合后并不完全按照DNA序列進行互補延伸擴增，而是在擴增過程中發生了跳躍擴增，導致擴增產物片段與預期產物片段不一致，即與其他核酸擴增方法擴增產物不一致。也就是說其擴增產物與PCR、LAMP、LIMA等擴增方法生成的擴增產物均不一致。這些方法引物在與目標DNA結合后都是沿著目標DNA復制延伸，而在本發明中引物在與目標DNA結合后并未完全沿著目標DNA復制延伸，導致擴增產物片段與預期產物片段不一致。

通過電泳及測序結果表明擴增產物主要是正向引物和反向引物互補序列通過幾個堿基鏈接而成的單體及多個由單體串聯形成的多聚體，這些鏈接引物的堿基與所設計的引物結構中目標DNA的片斷并不完全一致，導致本發明中擴增產物片段與其他核酸擴增方法擴增產物片段不一致（擴增產物與預期產物片斷不一致）。具體內容如下：以DNA雙鏈（見圖1）為模板設計多種引物結構均可實現核酸等溫擴增基因跳躍復制擴增法。

核酸擴增引物設計核心結構如圖2、圖3、圖4、圖5、圖6所示，結構中F₀引物是變值，但最好不能引起二聚體的任何一定長度的引物片段，每個F₀均是獨立的，兩個F₀可以設計為相同堿基序列也可以取不同堿基序列。F₀當然可以設計成目標反應區域任何DNA分子片段。

核心結構已是擴增反應的充分條件，加入引物可能起到加快反應的作用，當然F₀取值不同，可能形成更多的反應路徑，也就是引物可以和更多的結構反應，我們發明的是能擴增出新產物的核酸等溫擴增新方法，只要核心反應機理存在，引物設計結構就是可行的，所有的設計結構包括變通結構都是我們的保護范圍，在此可能發生的其它反應機理不再一一列舉了。

應用實例一：

按圖2引物結構設計引物，以檢測結核分枝桿菌（ Mycobacterium tuberculosis H37Rv complete genome GenBank: AL123456.3）DNA片段為例：