[發(fā)明專利]基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410190726.6
• 申請(qǐng)日: 2014-05-07
• 公開（公告）號(hào): CN104165999B
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鞠熀先;嚴(yán)楓;宗晨;吳潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué);江蘇省腫瘤醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。該方法的檢測(cè)溶液包括DNA1?抗體1偶聯(lián)物、DNA2?抗體2偶聯(lián)物、輔助DNA3、輔助DNA4、分子信標(biāo)DNA5和限制性內(nèi)切酶。目標(biāo)蛋白質(zhì)存在時(shí)，DNA1?抗體1與DNA2?抗體2形成夾心免疫復(fù)合物，使得分別與DNA1、DNA2雜交的DNA3、DNA4相互靠近，形成鄰位觸擊復(fù)合物，與DNA5雜交打開其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，染料Cy5遠(yuǎn)離猝滅劑產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。復(fù)合物與DNA5形成的雙鏈還能被內(nèi)切酶識(shí)別，將DNA5剪切后打開新的DNA5，如此循環(huán)可在位放大發(fā)光，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的高靈敏定量分析。該發(fā)明實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)快速、一步化檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、普適性高。

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明為一種基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。利用免疫反應(yīng)誘導(dǎo)核酸雜交，產(chǎn)生鄰位觸擊效應(yīng)，生成與發(fā)卡式分子信標(biāo)開關(guān)互補(bǔ)的序列，打開分子信標(biāo)，同時(shí)引入內(nèi)切酶循環(huán)策略，產(chǎn)生游離的化學(xué)發(fā)光染料，在位放大化學(xué)發(fā)光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)單、快速、高靈敏測(cè)定。

二、背景技術(shù)

蛋白質(zhì)標(biāo)志物的測(cè)定在癌癥的研究和診斷中扮演著重要的角色，其床旁檢測(cè)可以直接用作早期篩選、監(jiān)測(cè)治療和復(fù)發(fā)診斷，意義重大。酶聯(lián)免疫分析法為最常見的免疫檢測(cè)方法之一，雖然其已推廣應(yīng)用，但由于需要專業(yè)人員操作、步驟復(fù)雜、所需時(shí)間長(zhǎng)、試劑消耗多、工作量大、成本昂貴，不適于床旁檢測(cè)。所以發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的免疫分析方法，是床旁檢測(cè)一直以來所追求的目標(biāo)。

鄰位觸擊免疫分析是近年來發(fā)展起來的一種新型免疫分析方法，其基本分析原理為：用兩個(gè)或多個(gè)連有單鏈核苷酸的抗體檢測(cè)目標(biāo)抗原，一旦抗體與目標(biāo)抗原結(jié)合，抗體連接的單鏈核苷酸就會(huì)被充分拉近，進(jìn)行雜交反應(yīng)生成雙鏈DNA，進(jìn)一步作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR放大檢測(cè)，其后根據(jù)DNA的含量間接求得待測(cè)抗原的含量。鄰位觸擊效應(yīng)因采用雙識(shí)別機(jī)制，大大降低了交叉反應(yīng)，特異性高。此外，與其它免疫分析方法相比，可一步完成檢測(cè)，無需清洗、分離。但已建立的鄰位觸擊免疫分析方法主要采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，大大限制了應(yīng)用。DNA檢測(cè)的放大手段很多，不必局限于PCR檢測(cè)，本發(fā)明將發(fā)卡式分子信標(biāo)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)與鄰位觸擊效應(yīng)結(jié)合，設(shè)計(jì)了一種新的檢測(cè)方法。這里，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)是以化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的光為信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的方法。該方法敏感性高、簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，無放射性污染，在常規(guī)臨床分析和臨床研究中都有廣泛的應(yīng)用。

三、發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的內(nèi)容是：結(jié)合鄰位觸擊效應(yīng)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，通過設(shè)計(jì)發(fā)卡式分子信標(biāo)開關(guān)，引入內(nèi)切酶循環(huán)放大策略，提出一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的一步式均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明涉及一種基于鄰位觸擊效應(yīng)的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，如圖1所示。其原理在于該方法的檢測(cè)溶液包含DNA1-抗體1偶聯(lián)物、DNA2-抗體2偶聯(lián)物、輔助DNA3、輔助DNA4、分子信標(biāo)DNA5和限制性內(nèi)切酶。在目標(biāo)蛋白質(zhì)存在時(shí)，DNA1-抗體1偶聯(lián)物與DNA2-抗體2偶聯(lián)物通過夾心免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，同時(shí)DNA1與輔助DNA3、DNA2與輔助DNA4互補(bǔ)雜交，使輔助DNA3與輔助DNA4相互靠近，產(chǎn)生鄰位觸擊效應(yīng)，形成鄰位觸擊復(fù)合物，該復(fù)合物具有與分子信標(biāo)DNA5互補(bǔ)的序列，因而與分子信標(biāo)DNA5雜交，打開其發(fā)卡結(jié)構(gòu)。鄰位觸擊復(fù)合物與DNA5形成的雙鏈結(jié)構(gòu)能被限制性內(nèi)切酶識(shí)別，將DNA5剪切成超短鏈DNA，并從復(fù)合物上脫落，產(chǎn)生游離的化學(xué)發(fā)光染料Cy5，而該復(fù)合物可以與另一DNA5進(jìn)行雜交，打開其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并通過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行第二輪剪切，如此循環(huán)，可產(chǎn)生大量游離Cy5。在檢測(cè)溶液中加入化學(xué)發(fā)光底物，可獲得靈敏的Cy5化學(xué)發(fā)光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的高靈敏定量分析。

DNA1含有40個(gè)堿基，5’端修飾巰基，通過偶聯(lián)劑琥珀酰亞胺-4-環(huán)己烷-1-碳酸酯，與抗體1上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成DNA1-抗體1偶聯(lián)物。DNA2含有40個(gè)堿基，3’端修飾巰基，通過偶聯(lián)劑琥珀酰亞胺-4-環(huán)已烷-1-碳酸酯，與抗體2上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成DNA2-抗體2偶聯(lián)物。