[發明專利]制備克隆小型動物胚胎的方法

有效

• 申請號: 201410189550.2
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN105087653B
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 陳玉;李杏;李林;楊珍珍;杜玉濤
• 申請（專利權）人: 深圳華大方舟生物技術有限公司;深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/877
• 分類號: C12N15/877
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

本發明公開了制備克隆小型動物胚胎的方法，其包括以下步驟：提供離體的供體核細胞；提供離體的卵母細胞；于含有透明帶消化劑的卵母細胞去核液中，將卵母細胞進行去核處理，以便獲得去核卵母細胞；將去核卵母細胞與供體核細胞融合，以便獲得重構胚；將重構胚進行體外激活，以便獲得激活的重構胚；以及將激活的重構胚進行培養，以便獲得克隆小型動物胚胎。采用本發明的方法，能夠在消化卵母細胞透明帶的同時，適時快速進行切割去核，從而操作人員可以精確的把握去核時間，成功實現卵母細胞去核，并保證囊胚形成率，高效制備克隆小型動物胚胎。

技術領域

本發明涉及動物細胞工程技術領域。具體地，本發明涉及制備克隆小型動物胚胎的方法。

背景技術

體細胞核移植又稱克隆，是動物細胞工程中最常用的技術手段。通過電擊法或直接顯微注射法將具有較高分化程度的體細胞轉移至卵母細胞中，再經過化學激活，使其重新編程發育成胚胎，將其移植入代孕母體內，出生完整個體。1996年通過傳統克隆技術，在顯微操作儀器輔助下，首次獲得的體細胞克隆綿羊。2001年，科學家Gavor Vajta首次提出了手工克隆技術，該技術在體視顯微鏡下，手持特制刀片將無透明帶卵母細胞的核切除，從而達到去核目的。手工克隆與傳統克隆相比，無需使用顯微操作儀，及尖端的技術人員。但這些技術方法主要適用于大動物。

因而，現階段適于小型動物的手工克隆技術的研究具有重大的意義。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種適于小型動物，并能夠有效保證囊胚形成率的手工克隆技術。

因而，根據本發明的一個方面，本發明提供了一種制備克隆小型動物胚胎的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟：提供離體的供體核細胞；提供離體的卵母細胞；于含有透明帶消化劑的卵母細胞去核液中，將所述卵母細胞進行去核處理，以便獲得去核卵母細胞；將所述去核卵母細胞與所述供體核細胞融合，以便獲得重構胚；將所述重構胚進行體外激活，以便獲得激活的重構胚；以及將所述激活的重構胚進行培養，以便獲得所述克隆小型動物胚胎。發明人驚奇的發現，采用本發明的方法，能夠在透明帶為半消化狀態，即在消化透明帶的同時，適時快速進行切割去核，從而操作人員可以精確的把握去核時間，成功實現卵母細胞去核，并保證囊胚形成率，高效制備克隆小型動物胚胎。此外，根據本發明的實施例，本發明的方法成本低、操作簡單，易于推廣。

根據本發明的實施例，本發明制備克隆小型動物胚胎的方法還可以進一步具有下列附加技術特征：

根據本發明的實施例，所述透明帶消化劑為選自鏈蛋白酶和細胞松弛素B的至少一種。由此，能夠有效消化透明帶，便于精準的把握去核時間，易于去核操作。

根據本發明的實施例，所述卵母細胞去核液中包含：5-15μg/mL鏈蛋白酶；和/或1-5μg/mL細胞松弛素B。由此，透明帶半消化效果較好，易于去核操作。

根據本發明的實施例，所述卵母細胞去核液中包含：10μg/mL鏈蛋白酶；和/或2.5μg/mL細胞松弛素B。由此，透明帶半消化效果好，易于去核操作。

根據本發明的實施例，所述卵母細胞去核液中進一步包含：5-15體積％的TCM199培養基；0.1-0.3mg/mL碳酸氫鈉；0.1-0.3mg/mL丙酮酸鈉；3-4mg/mL赫佩斯鈉鹽；2-3mg/mL赫佩斯酸；0.1-0.3mg/mL谷氨酰胺；以及15-25體積％的牛血清。由此，能夠有效提高卵母細胞去核后的成活率。

根據本發明的實施例，所述卵母細胞去核液中包含：10體積％的TCM199培養基；0.17mg/mL碳酸氫鈉；0.20mg/mL丙酮酸鈉；3.60mg/mL赫佩斯鈉鹽；2.63mg/mL赫佩斯酸；0.20mg/mL谷氨酰胺；以及20體積％的牛血清。由此，去核過程中，卵母細胞損傷小，能夠有效提高卵母細胞去核后的成活率。