[發(fā)明專利]制備克隆小型動物胚胎的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410189550.2 | 申請日： | 2014-05-06 |
| 公開（公告）號： | CN105087653B | 公開（公告）日： | 2019-01-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 陳玉;李杏;李林;楊珍珍;杜玉濤 | 申請（專利權(quán)）人： | 深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司;深圳華大基因科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/877 | 分類號： | C12N15/877 |
| 代理公司： | 北京清亦華知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201 | 代理人： | 李志東 |
| 地址： | 518083 廣東省深圳市鹽*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 制備 克隆 小型 動物 胚胎 方法 | ||
1.一種制備克隆小型動物胚胎的方法，其特征在于，包括以下步驟：
提供離體的供體核細(xì)胞；
提供離體的卵母細(xì)胞；
于含有透明帶消化劑的卵母細(xì)胞去核液中，將所述卵母細(xì)胞進(jìn)行去核處理，以便獲得去核卵母細(xì)胞；
將所述去核卵母細(xì)胞與所述供體核細(xì)胞融合，以便獲得重構(gòu)胚；
將所述重構(gòu)胚進(jìn)行體外激活，以便獲得激活的重構(gòu)胚；以及
將所述激活的重構(gòu)胚進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得所述克隆小型動物胚胎，所述小型動物為鼠科、兔科、貓科、或犬科的至少一種；
所述透明帶消化劑為鏈蛋白酶和細(xì)胞松弛素B；
所述卵母細(xì)胞去核液中包含：
5-15μg/mL鏈蛋白酶；和
1-5μg/mL細(xì)胞松弛素B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述卵母細(xì)胞去核液中包含：
10μg/mL鏈蛋白酶；和2.5μg/mL細(xì)胞松弛素B。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述卵母細(xì)胞去核液中進(jìn)一步由如下組分組成：
5-15體積％的TCM199培養(yǎng)基；
0.1-0.3mg/mL碳酸氫鈉；
0.1-0.3mg/mL丙酮酸鈉；
3-4mg/mL赫佩斯鈉鹽；
2-3mg/mL赫佩斯酸；
0.1-0.3mg/mL谷氨酰胺；以及
15-25體積％的牛血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述卵母細(xì)胞去核液中進(jìn)一步由如下組分組成：
10體積％的TCM199培養(yǎng)基；
0.17mg/mL碳酸氫鈉；
0.20mg/mL丙酮酸鈉；
3.60mg/mL赫佩斯鈉鹽；
2.63mg/mL赫佩斯酸；
0.20mg/mL谷氨酰胺；以及
20體積％的牛血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述卵母細(xì)胞的透明帶半消化時(shí)，根據(jù)極體定位的方法，將所述卵母細(xì)胞的第一極體連同部分卵母細(xì)胞質(zhì)切除，以便實(shí)現(xiàn)所述去核處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述去核卵母細(xì)胞與所述供體核細(xì)胞融合，包括：
將所述去核卵母細(xì)胞均分為兩組；
將其中一組去核卵母細(xì)胞與所述供體核細(xì)胞進(jìn)行第一融合，以便形成去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞復(fù)合體；以及
將另一組去核卵母細(xì)胞與所述去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行第二融合，以便形成三體結(jié)構(gòu)的去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞-去核卵母細(xì)胞，所述三體結(jié)構(gòu)的去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞-去核卵母細(xì)胞即為所述重構(gòu)胚。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，利用細(xì)胞融合儀，于融合操作液中進(jìn)行所述第一融合和所述第二融合，
其中，
所述融合操作液由組下組分組成：
54.65mg/mL甘露醇；
1mg/mL聚乙烯醇；以及
0.145mg/mL硫酸鎂，
所述細(xì)胞融合儀的參數(shù)設(shè)置為DC 80V，40μs，AC 9V。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述重構(gòu)胚置于化學(xué)激活操作液中，于37℃、5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8小時(shí)，以便實(shí)現(xiàn)所述體外激活，
其中，所述化學(xué)激活操作液由如下組分組成：
4.789mg/mL氯化鈉；
0.36mg/mL氯化鉀；
0.159mg/mL磷酸鉀；
0.291mg/mL七水硫酸鎂；
2.1mg/mL碳酸氫鈉；
1mg/mL葡萄糖；
0.029mg/mL丙酮酸鈉；
0.146mg/mL谷氨酰胺；
0.37體積％的乳酸鈉；
0.038mg/mL乙二胺四乙酸；
0.1mg/mL聚乙烯醇；
5mg/mL牛血清白蛋白；
5μg/mL細(xì)胞松弛素B；以及
2.666mg/mL六水氯化鍶。
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