[發明專利]一種檢測及鑒別診斷氣溶膠中布魯氏桿菌的方法

有效

• 申請號: 201410188981.7
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103981261A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 何洪彬;趙貴民;王洪梅
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院奶牛研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

技術領域

本發明涉及一種檢測及鑒別診斷養殖場氣溶膠中布魯氏桿菌的方法，屬于生物檢測領域。

背景技術

氣溶膠(aerosol)是指懸浮在氣體中的固體和/或液體微粒與氣體載體共同組成的多相體系。根據微粒的成分可以劃分為生物氣溶膠和化學氣溶膠。在氣溶膠的體系中，把具有生命的氣溶膠粒子和活性粒子以及由有生命活性的機體所釋放到空氣中的各種質粒統稱為生物氣溶膠，又稱為微生物氣溶膠，主要分為細菌氣溶膠、病毒氣溶膠和真菌氣溶膠等，與人類及動物的健康密切相關。養殖場環境中的微生物氣溶膠的分布可造成以呼吸道傳播性的傳染病的暴發與流行，給畜牧業生產和人類健康帶來嚴重危害，尤其是當前集約化、高密度養殖環境下更容易形成微生物氣溶膠性的疾病流行。因此，通過監測養殖場環境中氣溶膠微生物，可以有效地預警預測傳染病的暴發流行。

布魯氏桿菌病(Brucellosis，也稱布氏桿菌病)是由布魯氏桿菌屬細菌引起的人、畜共患的常見傳染病。布魯氏桿菌屬于兼性胞內寄生的革蘭氏陰性短小桿菌，無鞭毛，不形成芽孢，有莢膜，是在嚴格厭氧條件下不生長的需氧菌，其外膜蛋白、脂多糖等成分是決定其感染力的主要因素。在家畜中以牛種布魯氏桿菌(B.abortus)、羊種布魯氏桿菌(B.melitensis)和豬種布魯氏桿菌(B.suis)最常發生，且可由牛、羊、豬傳染給人。本病廣泛分布于世界各地，每年4～8月為本病的高發季節，與牛羊繁殖、流產及牛羊肉的消費有關，高危人群是牛羊的飼養、屠宰、獸醫、畜產品加工等從業人員。我國目前在人、畜間仍有發生，給畜牧業和人類的健康帶來嚴重的危害。

現有技術中，實驗室檢測布魯氏桿菌病原的方法主要有細菌染色、分離培養和核酸檢測，核酸檢測主要是常規PCR法。目前，尚無常規PCR方法檢測養殖場氣溶膠中布魯氏桿菌的研究。

SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR可以利用熒光信號的積累實時監測整個PCR進程，通過標準曲線檢測目的基因并進行定量分析，同時結合溶解曲線Tm差異進行鑒別診斷的技術。該技術具有敏感性高、特異性強，重復性好等優點；此外操作簡便、價格低廉、結果直觀，在臨床檢測和對疾病進程的研究上具有很高的實用價值。目前，還沒有應用SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR技術開展養殖場氣溶膠中布魯氏桿菌的研究報道。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種檢測及鑒別診斷氣溶膠中布魯氏桿菌的方法。本發明通過采集養殖場不同環境中布魯氏桿菌氣溶膠樣本，提取布魯氏桿菌基因組DNA，應用SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR技術檢測布魯氏桿菌屬細菌，同時根據溶解曲線Tm值的不同對氣溶膠中牛種布魯氏桿菌、羊種布魯氏桿菌和豬種布魯氏桿菌進行鑒別診斷。利用本方法可以對養殖場環境中的布魯氏桿菌氣溶膠流行與傳播進行實時監測，為養殖場布魯氏桿菌的防控提供技術支持，也可以開展布魯氏桿菌病的流行病學調查，為布魯氏桿菌病的科學防控提供理論支撐。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種檢測及鑒別診斷氣溶膠中布魯氏桿菌的方法，步驟如下：

(1)采集氣溶膠樣本；

進一步地，采集氣溶膠樣本的方法為：采用國際標準的全玻璃液體沖擊式采樣器(all-glass-impinger，簡稱AGI)，以10mLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)為采樣介質，按照12.5L/min的采樣流量采集20min，收集養殖場環境中的氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA；

進一步地，提取基因組總DNA的方法為：將采集到的10mL氣溶膠樣本在室溫下12000r/min離心5min，棄上清液，應用細菌基因組DNA試劑盒(商業化產品，現有技術中的常規試劑盒)提取總DNA；

(3)檢測：以上述提取的基因組總DNA為模板，采用試劑盒進行SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR，具體如下：

所述試劑盒由特異性引物、pEASY-T3-VirB10陽性標準質粒、SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR試劑(現有技術中已有的常規試劑)和ddH₂O組成；

所述pEASY-T3-VirB10陽性標準質粒是由序列為SEQIDNO.10所示的DNA片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒，連接方法為所屬領域常規技術；

所述特異性引物選自①通用檢測引物對或/和②布魯氏桿菌牛種、羊種和豬種鑒別檢測引物對；

所述通用型檢測引物對的序列如下：