[發(fā)明專利]一種檢測及鑒別診斷氣溶膠中布魯氏桿菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410188981.7
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103981261A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何洪彬;趙貴民;王洪梅
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

1.一種檢測及鑒別診斷氣溶膠中布魯氏桿菌的方法，其特征在于：步驟如下：

(1)采集氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA；

(3)檢測：以上述提取的基因組總DNA為模板，采用試劑盒進(jìn)行SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具體如下：

所述試劑盒由特異性引物、pEASY-T3-VirB10陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑和ddH₂O組成；

所述pEASY-T3-VirB10陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒是由序列為SEQIDNO.10所示的DNA片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質(zhì)粒；

所述特異性引物選自①通用檢測引物對或/和②布魯氏桿菌牛種、羊種和豬種鑒別檢測引物對；

所述通用型檢測引物對的序列如下：

VirB10-2-F：5′-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3′；

VirB10-2-R：5′-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3′；

所述布魯氏桿菌牛種、羊種和豬種鑒別檢測引物對的序列具體如下：

牛種布魯氏桿菌特異性檢測引物對：

Abortus-F：5′-GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3′；

Abortus-R：5′-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3′；

羊種布魯氏桿菌特異性檢測引物對：

Melitensis-F：5′-AACAAGCGGCACCCCTAAAA-3′；

Melitensis-R：5′-CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3′；

豬種布魯氏桿菌特異性檢測引物對：

Suis-F：5′-CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3′；

Suis-R：5′-ACCGGAACATGCAAATGAC-3′；

(4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線：建立pEASY-T3-VirB10陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及擴(kuò)增體系的溶解曲線；

(5)判斷：當(dāng)所用特異性引物為通用檢測引物對時(shí)，若溶解曲線為S型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有布魯氏桿菌；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有布魯氏桿菌；

當(dāng)所用特異性引物為布魯氏桿菌牛種、羊種和豬種鑒別檢測引物對時(shí)，若對應(yīng)于牛種布魯氏桿菌特異性檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有牛種布魯氏桿菌；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有牛種布魯氏桿菌；

若對應(yīng)于羊種布魯氏桿菌特異性檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有羊種布魯氏桿菌；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有羊種布魯氏桿菌；

若對應(yīng)于豬種布魯氏桿菌特異性檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有豬種布魯氏桿菌；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有豬種布魯氏桿菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測及鑒別診斷氣溶膠中布魯氏桿菌的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，采集氣溶膠樣本的方法為：采用全玻璃液體沖擊式采樣器，以10mLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液為采樣介質(zhì)，按照12.5L/min的采樣流量采集20min，收集氣溶膠樣本。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測及鑒別診斷氣溶膠中布魯氏桿菌的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，提取基因組總DNA的方法為：將采集到的10mL氣溶膠樣本在室溫下12000r/min離心5min，棄上清液，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取總DNA。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測及鑒別診斷氣溶膠中布魯氏桿菌的方法，其特征在于：所述步驟(3)中，PCR的擴(kuò)增體系為：20μL的擴(kuò)增體系，包括2×SYBRPremixExTaqII10μL，模板2μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各0.5μL，RNaseFreeddH₂O7μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測及鑒別診斷氣溶膠中布魯氏桿菌的方法，其特征在于：所述步驟(3)中，PCR的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃30s，然后按照95℃變性5s、62℃退火延伸30s進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號；溶解曲線的條件為95℃10s、65℃60s，升溫至95℃，最后50℃30s反應(yīng)結(jié)束。