[發(fā)明專利]以糖蜜為原料提取生物素的方法及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410188963.9
• 申請(qǐng)日: 2014-05-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103926130A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉代成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28;G01N21/25
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以糖蜜為原料提取生物素的方法，以及生物素的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

生物素是生命活動(dòng)中必需的維生素之一，是機(jī)體內(nèi)許多酶的輔助因子，參加機(jī)體的羧化、脫羧和脫氫反應(yīng)，參與糖類、脂肪、蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝。生物素已廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、畜牧、生物發(fā)酵等領(lǐng)域。在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，生物素用量的控制直接影響著生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)、增殖、代謝和細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的滲透性以及谷氨酸產(chǎn)酸率的高低，由于大多數(shù)谷氨酸菌都是生物素缺陷型的，所以生物素的含量對(duì)生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用，因此開(kāi)展對(duì)生物素檢測(cè)的研究具有重要的意義。

糖蜜是一種粘稠、黑褐色、呈半流動(dòng)態(tài)的物質(zhì)，是制糖工業(yè)上不能再用來(lái)煮制糖品的廢料，但糖蜜中生物素的含量豐富，可作為良好的谷氨酸發(fā)酵的原料和添加劑，是目前谷氨酸生產(chǎn)中生物素的主要來(lái)源。但由于其中生物素的含量與糖蜜的來(lái)源、生產(chǎn)批次等密切相關(guān)，因此，為穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)酸率必須密切關(guān)注糖蜜的組成變化，準(zhǔn)確測(cè)定其中的生物素含量，以實(shí)現(xiàn)谷氨酸發(fā)酵中對(duì)生物素用量的控制。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的生物素的檢測(cè)方法有微生物法、熒光法、分光光度法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層掃描法等等。目前，對(duì)糖蜜中生物素的檢測(cè)，微生物法和高效液相色譜法最為常用，但存在以下缺陷：微生物法由于大多數(shù)菌株都不是專一性的，因此會(huì)帶來(lái)較大的檢測(cè)誤差，并且整個(gè)操作過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。高效液相色譜法投資大、溶劑用量大、成本較高，又由于糖蜜粘稠、色深、含有雜質(zhì)較多，故樣品處理即生物素的提取純化過(guò)程困難，且高效液相色譜法對(duì)樣品的純度要求又較高，對(duì)成分復(fù)雜、色素含量高、雜質(zhì)干擾大的糖蜜樣品，不宜用該法檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種以糖蜜為原料提取生物素的方法，本發(fā)明還提供了一種生物素的薄層層析掃描檢測(cè)方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

以糖蜜為原料提取生物素的方法，步驟如下：

(1)取糖蜜10～15g，加入100～150ml的80～95％(體積百分?jǐn)?shù))乙醇溶液于燒杯中，在40KHz，功率為300～500W，溫度60～70℃條件下超聲處理20～30分鐘，此過(guò)程中糖蜜由液體變?yōu)閴K狀；超聲處理后，取出塊狀糖蜜，剩余乙醇溶液降溫至5℃以下，過(guò)濾得殘?jiān)粚K狀糖蜜與殘?jiān)喜ⅲ?00～150ml與超聲處理同溫度、同濃度的乙醇溶液沖洗過(guò)濾，得糖蜜渣塊；

(2)將上述糖蜜渣塊加入到100～150ml的95～100％(體積百分?jǐn)?shù))的乙醇溶液(當(dāng)為100％時(shí)，為無(wú)水乙醇)中，在20KHz，300～500W，溫度為55～65℃，超聲探頭深入液面下3cm，間隔5秒超聲3分鐘設(shè)置下連續(xù)超聲20～30分鐘，此過(guò)程中，糖蜜塊已成黃土色粉狀；超聲處理后，趁熱過(guò)濾，得濾液和濾渣，用45～55ml的55～65℃的95～100％(體積百分?jǐn)?shù))乙醇溶液洗濾渣，得洗液和濾渣，合并濾液和洗液得乙醇濾液，濾渣加入5～8ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌提取20分鐘，過(guò)濾得DMF濾液；

(3)將乙醇濾液和DMF濾液合并，得生物素溶液(含有生物素的溶液)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2～3ml，作為下述檢測(cè)的樣品液。

一種生物素的薄層層析掃描檢測(cè)方法，步驟如下：

(1)取待檢測(cè)樣品液(即上述方法制備得到的生物素溶液)4μl，點(diǎn)在硅膠板(優(yōu)選10cm×10cm的涂有硅膠GF254高效薄層板)上，加入展開(kāi)劑，在展開(kāi)缸(10cm×12cm×15cm)內(nèi)展開(kāi)，展開(kāi)劑的飽和時(shí)間為60分鐘，展開(kāi)距離為6cm，展開(kāi)時(shí)間為15分鐘，然后將薄層板拿出放在通風(fēng)柜中晾干；同時(shí)，采用外標(biāo)一點(diǎn)法點(diǎn)4μl不同濃度的生物素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同時(shí)展開(kāi)；

所述展開(kāi)劑為二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的體積比為1～3:1～3:1～2:0.04～0.06，優(yōu)選3:3:2:0.06；

所述生物素標(biāo)準(zhǔn)品溶液包括濃度分別為0.05μg/μl，0.2μg/μl，0.25μg/μl，0.3μg/μl，0.4μg/μl的一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

所述生物素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方法為：精密稱取生物素標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自Sigma公司)1.29mg,加入N,N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成濃度為1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液；精密吸取50，200，250，300，400μl1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度分別0.05μg/μl，0.2μg/μl，0.25μg/μl，0.3μg/μl，0.4μg/μl的一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液；