[發明專利]一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法及試劑盒有效

申請號：	201410188272.9	申請日：	2014-05-06
公開（公告）號：	CN103981284A	公開（公告）日：	2014-08-13
發明（設計）人：	王洪梅;何洪彬	申請（專利權）人：	山東省農業科學院奶牛研究中心
主分類號：	C12Q1/70	分類號：	C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
代理公司：	濟南圣達知識產權代理有限公司 37221	代理人：	彭成
地址：	250100 山東省***	國省代碼：	山東;37
權利要求書：	查看更多	說明書：	查看更多
摘要：
搜索關鍵詞：	一種檢測氣溶膠口蹄疫病毒方法試劑盒
鉆瓜網技術展會專利詞庫專利權人專利榜在售專利公布日期熱門專利

【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種通過熒光定量SYBR?Green?I方法分型檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，以及特異性引物、試劑盒，屬于生物檢測領域。

背景技術

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的豬、牛、羊等偶蹄類動物發生急性、熱性、高度接觸性傳染病，一旦暴發，必須撲殺感染及接觸感染的動物。口蹄疫被世界動物衛生組織列為法定報告疫病，被我國列為一類動物疫病之首，不僅會造成巨大的直接經濟損失，而且嚴重危害畜牧業的健康發展以及相關產品的對外貿易，對國家的政治、經濟具有深遠的影響。

口蹄疫病毒有7個血清型和65個以上的血清亞型，血清型之間無交叉免疫現象，因而難以控制。我國為口蹄疫流行國家，主要流行O型、A型和Asia1型口蹄疫。2005年我國大面積爆發了Asia1型口蹄疫，2009年和2013年爆發了A型口蹄疫，近年來，均有O型口蹄疫的散發和流行，特別是隨著我國養殖業集約化、規模化的迅猛發展，口蹄疫的傳播風險也來越大。

由于養殖動物高度密集，患病動物呼出、排泄大量的病原微生物，造成舍內高濃度微生物氣溶膠的積聚，而且通過舍內外氣體的交換，病原微生物隨著大氣傳播、擴散，造成環境生物污染和傳染病傳播。口蹄疫病毒能在空氣中形成氣溶膠，病毒可隨風散播到50～100公里外的地方，傳播速度快，距離遠，難于防御。因此，通過建立一種適用于口蹄疫病毒氣溶膠的檢測方法，將為口蹄疫預報預警提供配套技術。

目前應用于氣溶膠病毒的檢測方法主要有培養法和分子生物學方法，實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數最敏感、最準確的分子生物學方法，具有靈敏度和特異性高、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，可應用于病原微量檢測。然而關于氣溶膠的口蹄疫病毒熒光定量PCR檢測及其分型方法未見報道。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種通過熒光定量SYBRGreenI方法分型檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，以及特異性引物、試劑盒。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，步驟如下：

(1)采集氣溶膠樣本；

進一步地，采集氣溶膠樣本的方法為：采用MS-1型多功能微生物采樣器，以10mL?pH值7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)為采樣介質，按照12.5L/min的采樣流量采集30min，收集養殖場環境中的氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本中病毒的cDNA；

進一步地，提取cDNA的方法為：取2mL氣溶膠樣本，應用病毒RNA提取試劑盒(商業化產品，現有技術中的常規試劑盒)提取總RNA；再參照反轉錄試劑盒(商業化產品，現有技術中的常規試劑盒)說明書進行反轉錄，獲得cDNA；

(3)檢測：以上述提取的cDNA為模板，采用試劑盒進行SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR，具體如下：

所述試劑盒由特異性引物、RT反應緩沖液、AMV反轉錄酶、Premix?Ex?Taq^TM?II、標準陽性質粒、無RNase的水組成。

所述標準陽性質粒包括陽性質粒pEASY-T3-5’UTR、pEASY-T3-O-VP1、pEASY-T3-A-VP1和pEASY-T3-A1-VP1；用于標準曲線的制備及氣溶膠口蹄疫病毒拷貝數的計算。

所述陽性質粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQ?ID?NO.9所示序列的第28-203位核苷酸的序列片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒，連接方法為所屬領域常規技術。