[發明專利]一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201410188272.9
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103981284A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 王洪梅;何洪彬
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院奶牛研究中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

1.一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：步驟如下：

(1)采集氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本中病毒的cDNA；

(3)檢測：以上述提取的cDNA為模板，采用試劑盒進行SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR，具體如下：

所述試劑盒由特異性引物、RT反應緩沖液、AMV反轉錄酶、Premix?Ex?Taq^TM?II、標準陽性質粒、無RNase的水組成；

所述標準陽性質粒包括陽性質粒pEASY-T3-5’UTR、pEASY-T3-O-VP1、pEASY-T3-A-VP1和pEASY-T3-A1-VP1；

所述陽性質粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQ?ID?NO.9所示序列的第28-203位核苷酸的序列片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒；

所述陽性質粒pEASY-T3-O-VP1是由ID?NO.10所示的序列片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒；

所述陽性質粒pEASY-T3-A-VP1是由SEQ?ID?NO.11所示的序列片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒；

所述陽性質粒pEASY-T3-A1-VP1是由SEQ?ID?NO.12所示的序列片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒；

所述特異性引物選自口蹄疫病毒檢測的通用引物對或/和O型、A型、Asia1型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對；

所述口蹄疫病毒檢測的通用引物對的序列如下：

引物1-5’UTR-F：5’-CGTTGCACTCCACACTTAC-3’；

引物2-5’UTR-R：5’-GACCAAGTAGGCGGAAAG-3’；

O型、A型、Asia1型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：

O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：

引物3-O-VP1F：5’-GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’；

引物4-O-VP1R：5’-CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’；

A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：

引物5-A-VP1F：5’-AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’；

引物6-A-VP1R：5’-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3’；

Asia1型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下：

引物7-A1-VP1F：5’-GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3’；

引物8-A1-VP1R：5’-CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’；

(4)建立標準曲線和溶解曲線：建立陽性標準質粒的標準曲線，以及擴增體系的溶解曲線；

(5)判斷：當所用特異性引物為口蹄疫病毒檢測的通用引物對時，若溶解曲線為S型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有口蹄疫病毒；

當所用特異性引物為O型、A型、Asia1型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對時，若對應于O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有O型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有O型口蹄疫病毒；

若對應于A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有A型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有A型口蹄疫病毒；

若對應于Asia1型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有Asia1型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有Asia1型口蹄疫病毒。

2.根據權利要求1所述的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，采集氣溶膠樣本的方法為：采用MS-1型多功能微生物采樣器，以10mLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液為采樣介質，按照12.5L/min的采樣流量采集30min，收集氣溶膠樣本。

3.根據權利要求1所述的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，提取cDNA的方法為：取2mL氣溶膠樣本，應用病毒RNA提取試劑盒提取總RNA；再應用反轉錄試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。