[發明專利]一種檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410187336.3
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103983767A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 徐麗明;邵安良;柯林楠;單永強;陸艷;楊昭鵬
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N21/78
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 王明霞

技術領域

本發明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒及其應用。

背景技術

由哺乳動物細胞外基質構成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被廣泛用于外科的創傷修復、組織重建和組織工程的支架材料等。異種器官也早已成為解決器官移植中供器官嚴重缺乏的潛在途徑之一。然而，動物源性生物材料或異種器官組織應用于人體所帶來的免疫學問題直接影響著這類材料使用的安全性和有效性。異種器官移植的最大障礙是供器官異種抗原與受者體內天然抗體結合后激活補體系統，攻擊供器官而產生的超急性免疫排斥反應(Hyperacute?rejection，HAR)，其發生時間在異種移植后的幾分鐘至數小時，供器官在短時間內發生功能衰竭使移植失敗。動物源性生物材料雖經各種去除抗原的處理，卻難以徹底去除所有的異種抗原，殘留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反應和免疫毒性而影響損傷愈合的重要因素。

已有研究顯示異種抗原α-半乳糖基抗原(α-1,3-galactosyle，α-Gal)是動物源性生物材料或異種器官移植超急性免疫排斥反應中的主要靶抗原。α-Gal是含有聚乳糖胺核心末端殘基的細胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，廣泛存在于豬和其它低等動物體內。由于人體及類人猿、舊世紀猴的半乳糖苷轉移酶基因有2個堿基錯位變異而不表達Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗α-Gal抗體(占總血清球蛋白的1％)，因此當人體接受含有Gal抗原的生物材料或異種器官移植時會導致超急性免疫排斥反應及慢性的免疫毒性反應。動物源性生物材料或異種器官移植中Gal抗原的去除成為降低免疫排斥和慢性免疫毒性反應的關鍵。目前，如何評價Gal抗原的去除和殘留Gal抗原誘導的免疫毒性尚存在著瓶頸。由于野生型低等動物都表達α-Gal抗原，因此無法利用野生型低等動物去評價α-Gal抗原相關的免疫毒性反應，只能用狒狒作為受體來考察α-Gal抗原陽性或者異體器官的免疫毒性反應，而這種動物稀少很難普及使用。因此，如何評價動物源性生物材料或異種器官組織的免疫毒性成為困惑檢測與監管機構因沒有方法和標準可依據而無法進行有效的安全性和質量監控，同時也限制了該類產品的研發和產業化發展。

為了填補檢測α-Gal抗原試劑盒的空白，特提出本發明。

發明內容

本發明的首要發明目的在于提出了一種檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒。

為了實現本發明的目的，采用的技術方案為：

本發明涉及一種檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒，所述的試劑盒中含有：固相α-1,3Gal抗原包被的孔板、封閉液、鼠M86抗體、二次抗體酶結合物、TMB顯色液、顯色終止液、組織裂解液、濃縮洗液、樣品稀釋液、陽性參考品和陰性參考品。

本發明的第一優選技術方案為：固相α-1,3Gal抗原包被的孔板預先采用α-Gal抗原進行包被，包被緩沖液為pH9.5、0.2M的碳酸鹽緩沖液，包被量優選為50～100μl；抗原濃度為10～100ng/ml，優選為50～100ng/ml。

本發明的第二優選技術方案為：所述的封閉液為人血清白蛋白；所述的樣品稀釋液為PBS；所述的顯色終止液為濃硫酸；所述的濃縮洗液為吐溫-20；所述的二次抗體酶結合物為辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgM酶結合物。

本發明的第三優選技術方案為：所述的陽性參考品為動物組織的凍干品,即為豬肝臟組織的凍干粉；陰性參考品為人源組織的凍干品，即為人胎盤組織的凍干粉。所述的陽性參考品和陰性參考品的制備方法為首先將新鮮組織經0～4℃生理鹽水漂洗后去除多余水分，再在0～4℃條件下進行勻漿；最后將勻漿組織進行凍干，分裝保存在-20℃。

本發明還涉及該檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒的制備方法：配制50ng～200ng/ml的Gal1,3Gal-BSA溶液，緩沖液為0.2M、pH9.5碳酸鹽緩沖液；取100μL?Gal1,3Gal-BSA溶液加入到孔板，4℃孵育過夜；次日用1％的人血清白蛋白進行封閉，封閉的條件優選4℃、1～2小時，然后用0.05％的吐溫-20/PBS洗液進行洗板三次，加洗液250μl/孔，浸泡30s，清洗三次；去除洗液后干燥，密封包裝，4℃保存。

本發明還涉及該檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)試驗樣品制備：將待測試驗樣品放進裂解液中進行低溫勻漿；α-Gal抗原陽性參考品和α-Gal抗原陰性參考品各加入裂解液中進行組織裂解；離心，取上清液備用；