[發明專利]一種檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410187336.3
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103983767A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 徐麗明;邵安良;柯林楠;單永強;陸艷;楊昭鵬
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N21/78
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 王明霞

1.一種檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有：固相α-1,3Gal抗原包被的孔板、封閉液、鼠M86抗體、二次抗體酶結合物、TMB顯色液、顯色終止液、組織裂解液、濃縮洗液、樣品稀釋液、陽性參考品和陰性參考品。

2.根據權利要求1所述的檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，固相α-1,3Gal抗原包被的孔板預先采用α-Gal抗原進行包被，包被緩沖液為pH9.5、0.2M的碳酸鹽緩沖液，包被量為10～100μl，優選為50～100μl；抗原濃度為10～100ng/ml，優選為50～100ng/ml。

3.根據權利要求1所述的檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，所述的封閉液為人血清白蛋白；所述的樣品稀釋液為PBS；所述的顯色終止液為濃硫酸；所述的濃縮洗液為吐溫-20；所述的二次抗體酶結合物為辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgM酶結合物。

4.根據權利要求1所述的檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，所述的陽性參考品為動物組織的凍干品，優選豬肝臟組織的凍干粉；陰性參考品為人源組織的凍干品，優選人胎盤組織的凍干粉。

5.根據權利要求4所述的檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，所述的陽性參考品和陰性參考品的制備方法為：首先將新鮮組織經0～4℃生理鹽水漂洗后去除多余水分，再在0～4℃條件下進行勻漿；最后將勻漿組織進行凍干，分裝保存在-20℃。

6.一種如權利要求1所述的檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的α-Gal抗原包被孔板的制備方法為：配制50ng～200ng/ml的Gal1,3Gal-BSA溶液，緩沖液為0.2M、pH9.5碳酸鹽緩沖液；取100μL?Gal1,3Gal-BSA溶液加入到孔板，4℃孵育過夜；次日用1％的人血清白蛋白進行封閉，封閉的條件優選4℃、1～2小時，然后用0.05％的吐溫-20/PBS洗液進行洗板三次，加洗液250μL/孔，浸泡30s，清洗三次；去除洗液后干燥，密封包裝，4℃保存。

7.一種如權利要求1所述的檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)試驗樣品制備：將待測試驗樣品放進裂解液中進行低溫勻漿；α-Gal抗原陽性參考品和α-Gal抗原陰性參考品各加入裂解液中進行組織裂解；離心，取上清液備用；

(2)標準曲線對照品制備：取兔血1.25×10⁶個/mL細胞數或者SP2/0細胞2.5×10⁶個/mL，進行倍比稀釋，共5～7個濃度梯度；

(3)樣品抗原-抗體反應：取試驗樣品的上清液和對照樣品的稀釋液各100μl放入離心管中,分別加入稀釋后的M86抗體溶液100μl，稀釋比例為1:50～1:100；混勻后4℃孵育過夜，或者37℃孵育1～3小時伴隨輕度搖動；離心后取上清備用；

(4)競爭性剩余抗體-固相抗原反應：取上述反應上清液各100μl加入到α-Gal抗原包被酶標板內，使反應上清液中的剩余M86抗體與孔板內的固相抗原充分反應，4℃孵育過夜，或者37℃孵育1～3小時；用洗液洗板3次；

(5)二次抗體反應和顯色：每孔加1:1000稀釋的酶標抗體100μl，置37℃孵育0.5～2小時；洗液洗板3次，甩干；加入酶底物顯色劑TMB，避光顯色后加入終止液，利用酶標儀在450nm測定光吸收值A450nm；

(6)判定實驗結果。

8.一種如權利要求1所述的檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒在動物源性生物材料中α-Gal抗原的定性或定量檢測中的應用，所述的動物源性生物材料包括動物來源的組織、器官、細胞及其動物組織或器官的衍生物、純化物。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的應用為在動物源性生物材料的殘留α-Gal的定性或定量檢測。