[發(fā)明專利]竹葉抗氧化肽的分離與純化方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410187223.3
• 申請日: 2014-05-05
• 公開（公告）號: CN103923166A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設計）人: 張國棟;唐曉芳;江燕竹;王金娟
• 申請（專利權）人: 西華大學
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16;G01N21/33
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.竹葉抗氧化肽的分離與純化方法，其特征在于：它的分離與純化方法為：(1)、竹葉粗蛋白的提取：準確稱取竹葉粉20克于干凈燒杯中，料液比1:20加入pH7.2、4℃預冷50mmol/L磷酸緩沖液400ml，攪拌均勻在4℃層析柜或冰箱中靜置12小時，經紗布過濾去掉殘渣，濾液經過冷凍離心(4℃，8000g，20min)，留取上清液，待用；采用硫酸銨沉淀法初步提取竹葉中的多肽蛋白，將固體硫酸銨緩慢加入到上清液中至終濃度為40％飽和度，同時使用磁力攪拌器緩慢攪拌，然后靜置1h以上，在4℃、10000g離心15min，棄去沉淀，收集上清液，在40％飽和度的硫酸銨上清液中加固體硫酸銨至80％飽和度，靜置1h以上，在4℃、10000g離心15min，收集沉淀，用10ml磷酸緩沖液溶解所得沉淀即得到竹葉蛋白粗提液；將80％硫酸銨鹽析的蛋白粗提液，裝入去離子水清洗過的透析袋，用pH7.2、50mmol/L磷酸緩沖液4℃下進行透析除鹽，中間多次更換緩沖液，透析好的粗提液4℃保存?zhèn)溆茫瑢λ玫拇痔針悠愤M行超氧陰離子清除自由基能力檢測；(2)、離子層析：(a)、DEAE-Sephadex?A-50的處理和層析柱的填裝：稱取一定量的DEAE-Sephadex?A-50，用起始緩沖液(50mmol/L磷酸緩沖液，pH7.2)浸泡，沸水浴2h，完全溶脹之后，用起始緩沖液清洗并采用傾倒法除去其中的細小顆粒，將處理好的離子交換劑上柱，利用重力沉降法裝填1.6cm×18cm柱子，裝填好的層析柱致密均勻、無氣泡，最終柱體積為16ml，將層析柱與起始緩沖液儲液器，恒流泵和紫外檢測儀相連(λ＝280nm，0.05A)，檢測密閉性并用起始緩沖液洗脫層析柱，使其達到交換平衡，并將紫外檢測儀調零，為保持蛋白質活性，試驗操作可在4℃層析柜中進行，另外此時所有設備和試劑均應在4℃預冷；(b)、加樣：樣品經過冷凍離心(10000g，15min，4℃)除去顆粒物，取澄清液，加樣前先將層析柱上端擰開，利用重力作用將床面多余的緩沖溶液自然排干，當床面剛好暴露時將層析柱下端閥門關閉此時柱內液體不能流出，用吸管將預處理好的樣品加到床面上，此時不能破壞床面的平整，以免造成區(qū)帶的扭曲和傾斜，然后打開柱下端閥門，受重力作用樣品溶液進入床面，最后用起始緩沖液加入柱內床面上2～3cm處，擰緊層析柱上口；(c)、洗脫：首先用起始緩沖液洗滌柱床，將起始條件下不能被吸附的物質從柱中洗去，在色譜圖上形成穿透峰，洗滌過程需進行到峰后紫外吸收重新回到初始值附近為止，洗滌過程完成之后，開始進行梯度洗脫，洗脫液為pH7.2，50mmol/L磷酸緩沖液，NaCl濃度在0～0.5mol/L呈線性變化；(d)、樣品收集：將洗脫出的溶液用蛋白質自動部分收集儀收集，收集體積為每管4ml，流速為1ml/min，將收集好的蛋白溶液進行超氧陰離子清除自由基能力檢測，收集280nm峰和超氧陰離子自由基清除活性峰重疊區(qū)域，經透析除鹽，冷凍干燥，備用；(e)、DEAE-Sephadex?A-50的再生、清洗和儲存：用高濃度NaCl溶液清洗色譜柱可以除去以離子鍵與交換劑結合的物質，當色譜柱上結合了以非離子鍵吸附的污染物，可在DEAE-Sephadex?A-50清洗pH范圍內進行堿酸交替清洗，在徹底清洗后可浸泡在含20％乙醇的0.2mol/L乙酸中于4～8℃保存；(3)、凝膠過濾層析：(a)、SephadexG-75的預處理：SephadexG-75干粉采用洗脫液浸泡，沸水浴3h，溶脹過程中不要過分攪拌，以防顆粒破碎，凝膠充分溶脹后用傾倒法將不易沉下的較細顆粒除去，將溶脹后凝膠抽干，用10倍體積的洗脫液處理約1h，攪拌后繼續(xù)用傾倒法除去懸浮的較細顆粒；(b)、裝柱：將層析柱垂直裝好，關閉出口，加入洗脫液約1cm高，將處理好的凝膠用等體積洗脫液攪成漿狀，自柱頂部沿管內壁緩緩加入柱中，待底部凝膠沉積約1～2cm高時，打開柱出口讓水流出，同時不斷緩慢加入凝膠懸液，高徑比為48/1.6，體積為96.5ml；(c)、平衡：將洗脫液與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱入口相連，用2～3倍體積的洗脫液平衡，流速為0.5ml/min；(d)、加樣與洗脫：將柱中多余的液體放出，使液面剛好蓋過凝膠，關閉出口，將2ml樣品(15mg/ml)，沿層析柱管壁小心加入，加完后打開層析底端出口，當樣品液面降至與凝膠面相平時關閉層析柱出口，用少量洗脫液洗柱內壁2次，加洗脫液至液層4cm左右，接上恒流泵，調節(jié)好流速(0.5ml/min)，開始洗脫；(e)、收集與測定：用部分收集器收集洗脫液，每管2ml,紫外檢測儀280nm處檢測，繪制洗脫曲線，同時測定其超氧陰離子自由基清除活性大小，收集280nm峰和超氧陰離子自由基清除活性峰重疊區(qū)域，將收集液冷凍干燥，備用；(4)、超氧陰離子自由基(O2·—)清除能力測定：(a)、實驗試劑的配制：

A液(pH＝8.2，50mmol/L?Tris-HCl緩沖液，內含1mmol/L?EDTA-2Na)：量取2.1ml濃HCl，加蒸餾水定容到250ml，得到0.1mol/L?HCl溶液；稱取三羥甲基氨基甲烷3g，加蒸餾水溶解，再加入114.5ml0.1mol/L?HCl溶液，用蒸餾水定容至500ml，制得pH8.2、濃度為50mmol/L的Tris-HCl緩沖液液；

B液(鄰苯三酚溶液)：稱取0.378g鄰苯三酚，用0.01mol/L?HCl溶液溶解定容至500ml，得濃度為3mmol/L的鄰苯三酚溶液；

(b)、鄰苯三酚自氧化速率的測定

取5.5mlA液于15ml的比色管中，混勻后在25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入在25℃水浴中預熱過的B液，迅速搖勻后倒入比色皿，用紫外分光光度計在325nm下每隔30s測定一次吸光度，共反應5min，將自氧化速率控制在0.060～0.065A/min，將記錄的數據以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，作直線回歸得到的斜率表示鄰苯三酚自氧化速率V₀，以A液為空白對照，記錄結果；

(c)、加入樣品液后鄰苯三酚自氧化速率的測定

取(5.5-x)ml?A液，xml樣品液于15ml的比色管中，混勻后在25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入在25℃水浴中預熱過的B液，迅速搖勻后倒入比色皿，用紫外分光光度計在325nm下每隔30s測定一次吸光度，共反應5min，將記錄的數據以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，作直線回歸得到的斜率表示加入樣品液后鄰苯三酚自氧化速率V₁，以pH8.2Tris-HCl緩沖液為空白對照，記錄結果；

(d)、計算抑制率

S(%)==V0-V1V0×100]]>

式中：V₀為鄰苯三酚自氧化時反應速率；

V₁為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化時反應速率；

(5)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：(a)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純化的竹葉抗氧化肽的純度；(b)、相對分子質量的計算：

(1)、分別量出標準蛋白質、待測蛋白質區(qū)帶中心距分離膠頂端的距離，按以下計算相對遷移率：

相對遷移距離＝蛋白質分子遷移距離(cm)/染料遷移距離(cm)

(2)、分析圖譜，繪制標準曲線，以標準蛋白的相對分子質量的對數為縱坐標，相對遷移距離為橫坐標作圖，根據樣品蛋白質分子的相對遷移距離，從標準曲線上查出其相對分子質量，

log?Mr＝K-bX

其中，Mr為分子量，X為相對遷移率，K、b均為常數；

(6)、反相高效液相色譜：反相高效液相色譜的分離條件及參數：(a)、色譜柱填料0.5μm，C18為反相柱，尺寸為10mm×250mm；(b)、樣品：將冷凍干燥的竹葉抗氧化肽用去離子水溶解，經0.45μm濾膜過濾，進樣量20μl，流速1ml/min；(c)、流動A：去離子水，含0.1％三氟乙酸，經0.45μm濾膜過濾；(d)、流動B：純乙腈，含0.1％三氟乙酸，經0.45μm濾膜過濾；(e)、洗脫條件：以流動相B體積分數為0％-100％線性梯度變化作為洗脫液。