[發(fā)明專利]一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410186729.2
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103981259A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 王保玉;劉建民;白建平;韓作穎;劉健;苗彪;趙娜
• 申請（專利權）人: 山西晉城無煙煤礦業(yè)集團有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 太原晉科知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 鄭晉周

技術領域

本發(fā)明屬于地層水微生物研究領域，具體為一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法。

背景技術

煤層氣（Coalbed?gas），俗稱瓦斯，是成煤過程中生成、并以吸附和游離狀態(tài)賦存于煤層及周巖的自儲式天然氣體，其中CH4的體積分數(shù)最高在95%以上。據(jù)2006年國家油氣資源評價，我國埋深小于2000m的煤層氣資源量達到36.81×1012?m³，與我國天然氣的遠景資源量基本相當。隨著國民經(jīng)濟的快速增長，我國對能源的需求日益增多。煤層氣作為非常規(guī)天然氣，是我國天然氣資源的重要補充來源。開發(fā)和利用煤層氣資源，可減少或避免煤礦瓦斯災害的發(fā)生，大幅度降低溫室氣體的排放，保護生態(tài)環(huán)境，具有重要的現(xiàn)實意義。

煤層氣一般分為生物成因煤層氣和熱成因煤層氣兩類。生物成因煤層氣是指在微生物作用下，煤中部分有機質轉化為以甲烷為主要成分的氣體。因此，研究煤層或煤層水中的微生物及其多樣性，分析參與煤降解和成氣過程中的微生物種類，有助于揭示生物成因煤層氣的生成機理，也為煤層氣的二次開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

傳統(tǒng)上研究環(huán)境中微生物多樣性的方法有很多，一般先對微生物進行培養(yǎng)，再通過分子生物學方法，如：末端限制性內(nèi)切酶片段長度多樣性（T-RFLP）、熒光原位雜交（FISH）、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）等分析微生物群體的種類。這些技術共有的缺點是在進行檢測時，需要樣品的量較大，操作繁瑣，費時費力，靈敏度低，對樣品中豐度較低的物種不能有效檢測出，難區(qū)分樣品中相似度較高的物種，僅能揭示樣品中很少一部分的微生物種類。因此，在研究樣品中微生物的多樣性方面有很大的局限。而宏基因組學，是以特定生境中的整個微生物群落作為研究的對象，不需對微生物進行分離培養(yǎng)，采用新一代高通量測序技術直接對環(huán)境微生物總DNA進行研究，測序數(shù)據(jù)能很好的滿足分析微生物群體物種多樣性和物種豐度等要求。

申請?zhí)枮?01110005095.2的專利《一種煤層氣田地下水微生物檢測方法》通過樣品采集、DNA?提取、16S?rDNA文庫構建以及DGGE?分析，從而對地下水微生物群落結構做出分析。該專利并未提供出具體的實施步驟，通過該種方法，檢測出古菌只有產(chǎn)甲烷古菌，且僅有甲烷八疊球菌屬和甲烷葉菌屬兩個屬的產(chǎn)甲烷菌；細菌主要為硬壁菌門，變形桿菌門和擬桿菌門。僅揭示出樣品中很少一部分的微生物種類。對于樣品中豐度較低的物種并沒有有效的檢測出來。因而導致該分析存在較大的誤差，不能全面、精準的揭示生物成因煤層氣的生成機理，也不能有效的為煤層氣的二次開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有對環(huán)境中微生物多樣性的研究存在較大局限性，需要樣品的量較大，操作繁瑣，費時費力，靈敏度低，對樣品中豐度較低的物種不能有效檢測出，難區(qū)分樣品中相似度較高的物種，僅能揭示樣品中很少一部分的微生物種類等問題，提供了一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明能更準確的分析出煤層水中微生物的多樣性和物種豐度。

本發(fā)明由如下技術方案實現(xiàn)的：一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法，步驟如下：

（1）煤層水樣采集：厭氧條件下采集煤層水樣，用于存放水樣的裝置滅菌后置于超凈工作臺上，將氮氣瓶或氬氣瓶上連接的導管另一端連接過濾器后置于裝置中，打開氣瓶閥門，通入氣體完全置換其中的空氣；然后加入終濃度為0.05%的半胱氨酸作還原劑，-20^oC密閉保存；

（2）微生物菌體的富集和DNA提取：無菌操作臺上將采集的水樣通過真空抽濾裝置過濾，用0.22μm的細菌微孔濾膜收集過濾后的菌體和其它固體物質；用OMEGA^ò水樣DNA提取試劑盒提取濾膜上的微生物總DNA；

（3）用特異性引物擴增16S?rDNA?V4高變區(qū)：設計16S?rDNA?V4高變區(qū)的特異性引物，擴增該高變區(qū)DNA片段；

（4）Illumina平臺測序分析：用帶有Illumina通用接頭序列的引物對擴增的高變區(qū)DNA片段進行擴增，構建DNA文庫，用Illumina測序儀對樣品進行雙末端測序，獲得讀序列；

（5）原始測序數(shù)據(jù)處理：使用Mothur軟件過濾原始讀序列，去除接頭污染的序列、去除低復雜度序列及含N的堿基數(shù)的序列，得到凈序列；根據(jù)序列的重疊關系，利用Velvet或AbySS等拼接軟件將凈序列拼接成標簽序列，即全長的V4區(qū)序列；