[發明專利]一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法

無效

• 申請號: 201410186729.2
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103981259A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 王保玉;劉建民;白建平;韓作穎;劉健;苗彪;趙娜
• 申請（專利權）人: 山西晉城無煙煤礦業集團有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 太原晉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 鄭晉周

1.一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法，其特征在于：步驟如下：

（1）煤層水樣采集：厭氧條件下采集煤層水樣，用于存放水樣的裝置滅菌后置于超凈工作臺上，將氮氣瓶或氬氣瓶上連接的導管另一端連接過濾器后置于裝置中，打開氣瓶閥門，通入氣體完全置換其中的空氣；然后加入終濃度為0.05%的半胱氨酸作還原劑，-20^oC密閉保存；

（2）微生物菌體的富集和DNA提取：無菌操作臺上將采集的水樣通過真空抽濾裝置過濾，用0.22μm的細菌微孔濾膜收集過濾后的菌體和其它固體物質；用OMEGA^ò水樣DNA提取試劑盒提取濾膜上的微生物總DNA；

（3）用特異性引物擴增16S?rDNA?V4高變區：設計16S?rDNA?V4高變區的特異性引物，擴增該高變區DNA片段；

（4）Illumina平臺測序分析：用帶有Illumina通用接頭序列的引物對擴增的高變區DNA片段進行擴增，構建DNA文庫，用Illumina測序儀對樣品進行雙末端測序，獲得讀序列;

（5）原始測序數據處理：使用Mothur軟件過濾原始讀序列，去除接頭污染的序列、去除低復雜度序列及含N的堿基數的序列，得到凈序列；根據序列的重疊關系，利用Velvet或AbySS拼接軟件將凈序列拼接成標簽序列，即全長的V4區序列；

（6）完成物種分類：通過16S?rDNA?V4高變區數據庫比對，將非冗余的標簽序列進行物種注釋并聚類成操作分類單位，完成物種多樣性和物種豐度分析。