[發(fā)明專利]一種體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410186288.6
• 申請(qǐng)日: 2014-05-05
• 公開（公告）號(hào): CN103923837A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付雍;徐文岳;丁艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/10
• 分類號(hào): C12N1/10;C12R1/90
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法。

背景技術(shù)

瘧原蟲(Plasmodium)是一類單細(xì)胞、寄生性的原生動(dòng)物，是人體瘧疾的病原體。瘧疾是一種嚴(yán)重危害人體健康的寄生蟲病，全世界約二分之一人口受威脅。隨著各瘧原蟲基因組測(cè)序的相繼完成，瘧原蟲研究已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代。目前，許多與瘧原蟲入侵、發(fā)育增殖、致病以及免疫逃避有關(guān)的重要基因的功能都尚未得以闡明，致使瘧疾防治和疫苗研制工作進(jìn)展緩慢，而對(duì)瘧原蟲各種基因及其產(chǎn)物的功能研究是制備有效疫苗和抗瘧藥物的前提。基因敲除技術(shù)是功能基因組學(xué)研究中最直接和最有效的方法，建立一種快速獲得基因敲除瘧原蟲的方法可以加快瘧原蟲基因功能的研究。但是，基因敲除技術(shù)需要使用成熟裂殖體，而成熟裂殖體需要在小鼠體內(nèi)增殖，步驟繁瑣費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，急需一種體外培養(yǎng)快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供體外培養(yǎng)快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，其操作簡單，不需要在小鼠體內(nèi)繁殖，并且繁殖后的成熟裂殖體能夠用于轉(zhuǎn)染。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，包括如下步驟：

(1)選擇原蟲率為25～30％的液氮凍存瘧原蟲，將其置于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)迅速解凍，離心，沉淀用瘧原蟲培養(yǎng)基重懸后再加入瘧原蟲培養(yǎng)基洗滌，離心收集沉淀，所述瘧原蟲培養(yǎng)基為含有胎牛血清、紅細(xì)胞、肝素、青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基；

(2)將步驟(1)所得沉淀用所述瘧原蟲培養(yǎng)基重懸，再加入所述瘧原蟲培養(yǎng)基混勻，在培養(yǎng)液中灌輸N₂、CO₂和O₂的混合氣體，灌輸完畢立即封閉瓶口，然后置于37℃、100r/min的條件下培養(yǎng)12～14小時(shí)；

(3)取新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為72％Percoll分離液，然后向分離液中加入步驟(2)的培養(yǎng)液，并用水平式離心機(jī)在350g條件下離心25min，離心完畢，取中間層液體，然后用所述瘧原蟲培養(yǎng)基清洗，離心棄上清，得瘧原蟲成熟裂殖體。

優(yōu)選的，所述瘧原蟲培養(yǎng)基中胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為20％，紅細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)為10％，肝素的濃度為75000單位/L，青霉素的濃度為10⁵單位/L，鏈霉素的濃度為100mg/L。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述混合氣體中N₂、CO₂和O₂的體積分?jǐn)?shù)分別為90％、5％和5％。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述混合氣體的灌輸時(shí)間為90s。

更優(yōu)選的，所述體積分?jǐn)?shù)為72％Percoll分離液的制備方法為取Percoll原液與濃度為1.5M的NaCl按體積比為1:9混合，然后濃度為0.15M的NaCl稀釋至Percoll體積分?jǐn)?shù)為72％。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了一種體外快速增殖瘧原蟲成熟裂殖體的方法，無需在小鼠體內(nèi)增殖的步驟，利用此方法可以體外培養(yǎng)快速增殖獲得大量的瘧原蟲成熟裂殖體，時(shí)間短，效率高，裂殖體數(shù)量多，數(shù)量可達(dá)到10⁷～10⁸，多于傳統(tǒng)在小鼠體內(nèi)增殖方法獲得瘧原蟲成熟裂殖體的數(shù)量，此外獲得的成熟裂殖體可用于轉(zhuǎn)基因，如基因敲除等，具有經(jīng)濟(jì)高效、省時(shí)省力且成功率高等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：

圖1為兩種方法分離后的裂殖體染色結(jié)果圖(A：實(shí)施例1方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體；B：傳統(tǒng)方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體)。

圖2為兩種方法獲得的裂殖體數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖(1：實(shí)施例1方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體數(shù)量；2：傳統(tǒng)方法分離的瘧原蟲成熟裂殖體數(shù)量)。

圖3為基因敲除質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4為基因敲除質(zhì)粒對(duì)瘧原蟲基因的敲除原理圖。

圖5為基因敲除瘧原蟲凝膠電泳鑒定圖(A：野生型瘧原蟲和轉(zhuǎn)染瘧原蟲的UIS3基因檢測(cè)結(jié)果；B：5’端插入序列和3’端插入序列檢測(cè)結(jié)果)。

具體實(shí)施方式