[發明專利]一種高純度藻藍蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201410186021.7
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103992402A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 歐瑜;袁志軍;李靖
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C07K14/795
• 分類號: C07K14/795;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于蛋白質工程或生化分離純化領域，具體涉及一種高純度藻藍蛋白的制備方法。?

背景技術

藻藍蛋白(phycocyanin)是一種存在于藍藻細胞中的光合色素，由含發色團的α和β亞基組成，這兩個亞基各具有約20kDa的分子量。在藻藍蛋白中這兩個亞基通常組合成單體(αβ)、三聚體(αβ)₃和六聚體(αβ)₆，因此分子量范圍也從44到260kDa不等。藻藍蛋白是一種天然的藍色著色劑，被廣泛用作保健飲料、糖果著色劑和化妝品中，還有些因其具有熒光免疫性被用作生化示蹤劑。此外，藻藍蛋白已經被證明具有重要的藥理作用，包括保肝、抗氧化、抗炎、抗癌和抗糖尿病等活性。由于具有巨大的商業和科研價值，因而藻藍蛋白的提取純化受到重視。藻藍蛋白的純度通常用A620/A280來表示，等級劃分為0.7＜食品級＜3.0＜反應級＜4.0＜分析級，因此藻藍蛋白的純度越高，價格越高。藻藍蛋白具有良好的水溶性，分離純化過程中的pH值變化、離子強度、光和溫度是影響藻藍蛋白分子穩定性的重要因素。藻藍蛋白在高于40℃以及pH＜4或者pH＞8.5的條件下容易變性，喪失活性，現有的藻藍蛋白提取純化工藝中存在著難以保證蛋白質活性、工藝流程復雜、生產成本居高不下、產品質量不穩定的缺陷，這些都嚴重制約了藻藍蛋白的應用。?

發明內容

本發明的目的是提供一種高純度藻藍蛋白的制備方法。?

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：?

一種高純度藻藍蛋白的制備方法，包括以下步驟：?

(1)取新鮮螺旋藻粉，與磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L)按1∶10-1∶15(質量/體積)充分混勻，得到螺旋藻懸液，常溫避光攪拌2小時充分混懸，反復凍融7-10次破除細胞壁，離心去除藻泥，得到上清液I。?

(2)向上清液I中加入硫酸銨固體，邊加邊攪拌，并盡量避免出現氣泡，4℃沉降8小時以上，離心得到含有藻藍蛋白的上清液II。?

(3)上清液II中繼續加入硫酸銨固體，邊加邊攪拌，并盡量避免出現氣泡，4℃沉降8小時以上，離心得到含有藻藍蛋白的沉淀。?

(4)用少量磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L)溶解沉淀后轉移至透析袋中，4℃透析24小?時，每隔4小時換一次透析用緩沖液，收集透析袋中的溶液，得到藻藍蛋白粗提液。?

(5)將藻藍蛋白粗提液上樣于弱陰離子交換柱DEAE?Sepharose?FF，進行梯度洗脫，收集A620/A280＞3的流出組分。?

(6)將上述收集的組分透析除鹽后，上樣于強陰離子交換柱SOURCE30Q，進行梯度洗脫，收集A620/A280＞4的流出組分。?

(7)向上一步收集的組分中加入硫酸銨固體，4℃沉降8小時以上，離心除去上清液得到藻藍蛋白沉淀，此沉淀用少量磷酸鹽緩沖液溶解并且透析后，得到高純度藻藍蛋白。?

以上步驟所述的離心條件為4℃，8000-12000rpm，30min。?

步驟(2)所述的加入硫酸銨固體至20％-30％飽和濃度，離心取上清。?

步驟(3)所述的加入硫酸銨固體至40％-60％飽和濃度，離心取沉淀。?

步驟(4)所述的透析袋截留分子量為8000-14400。?

步驟(5)所述的DEAE?Sepharose?FF梯度洗脫液為含有0.1-0.5mol/LNaCl，pH7.0，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。?

步驟(6)所述的SOURCE30Q梯度洗脫液為含有0-0.3mol/L?NaCl，pH7.0，0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液。?

步驟(7)所述的加入硫酸銨固體至40％飽和濃度，離心取沉淀。?

與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：?

本發明從螺旋藻中提取高純度藻藍蛋白的方法，以磷酸鹽緩沖液作為溶解體系，采用反復凍融的方法使目的蛋白從細胞內溶出，離心除去藻泥后，第一次鹽析除去部分雜質，第二次鹽析沉淀大部分藻藍蛋白，通過DEAE?Sepharose?FF離子交換柱分離除去部分雜蛋白，通過SOURCE30Q離子交換柱進一步除去雜蛋白，再經過一次鹽析，最終得到純度大于4.5的藻藍蛋白。?

本發明使用的原料鈍頂螺旋藻來源廣泛，藻藍蛋白提取工藝簡單高效，成本低廉。?

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的DEAE?Sepharose?FF離子交換柱層析圖譜。?