[發(fā)明專利]一種實體熒光納米微球及其制備方法和應用

有效

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• 申請日: 2014-05-05
• 公開（公告）號: CN103940798A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設計）人: 鄭忠亮;吳瓊水;蔡磊;朱輝
• 申請（專利權）人: 武漢紐康度生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/558;B82Y40/00
• 代理公司: 北京匯澤知識產(chǎn)權代理有限公司 11228
• 代理人: 孫艷敏

技術領域

本發(fā)明涉及熒光檢測技術領域，具體涉及一種實體熒光納米微球及其制備方法和在免疫定量層析中的應用。

背景技術

側向層析法在疾病快速診斷、小分子快速檢測等領域已得到了廣泛的應用。其原理是將特異性的抗原或抗體包被到硝酸纖維素膜上，構成檢測線，將二抗包被在距離檢測線2～3毫米的區(qū)域構成質控線。當樣本中的目標分子與帶有特定標記物的檢測抗體結合后，從硝酸纖維素膜的上樣端向吸水端層析。由于毛細管作用，復合物將沿著膜向前移動，但移動到檢測線時，樣品中的目標分子將被檢測線中的捕獲抗體捕捉而停留在檢測線上，多余的檢測抗體則通過檢測線后被質控線的二抗所捕捉。常用的標記物為膠體金顆粒、酶以及著色微球。膠體金顆粒和著色微球是通過靜電吸附將抗原或抗體標記到顆粒表面，通過觀察膠體金顆粒或著色微球在檢測線上的聚集顯色判斷檢測結果。而酶標記則通過催化底物顯色，顯示檢測結果。以上標記技術都是通過顯色和比色的方法來進行檢測，存在依靠肉眼識別、靈敏度低、無法精確定量等缺點。

傳統(tǒng)的側向層析產(chǎn)品主要是金標試紙卡。金標試紙卡是主要利用膠體金的電荷性通過靜電相互作用標記抗體、層析顯色的檢測技術，該技術主要用于定性檢測，如早早孕等產(chǎn)品。隨著CCD圖像技術的發(fā)展，膠體金發(fā)展出半定量產(chǎn)品，即通過T線和C線顏色的深淺進行定量檢測。但這種半定量檢測類似于照相比色定量技術，具有分辨率低，精確度低，誤差很大的缺點。

熒光標記技術具有靈敏度高、操作簡單等特點，已被廣泛用于生物檢測領域。如DNA測序、蛋白表達分析、細胞成像、活體成像、臨床診斷等。熒光微球技術是將聚苯乙烯羧基微球、熒光染料標記系統(tǒng)、激光技術、應用流體學及微球專用流式細胞儀等有機整合在一起的一項新技術，通過熒光微球信號來進行實驗數(shù)據(jù)采集和分析，具有快速分析多重生物反應的特點及高靈敏度和特異性，可用于抗原抗體、核酸探針檢測等領域的研究。

通常的熒光微球多為表面熒光微球，即將熒光分子通過特定的官能團偶聯(lián)到微球表面制得，表面熒光微球存在熒光較弱、均一性較差等不足。

發(fā)明內容

為了解決現(xiàn)有技術中的上述問題，本發(fā)明提供了一種實體熒光納米微球的制備方法。

本發(fā)明建立了一種基于近紅外熒光分子的聚苯乙烯材料合成熒光納米微球的方法，將近紅外熒光分子偶聯(lián)到苯乙烯分子上，通過聚合反應，整合到聚乙烯微球的分子內部。獲得的微球屬于實體熒光微球，熒光很強，熒光均一性很好。

本發(fā)明的技術方案：

一種實體熒光納米微球的制備方法，是將羧基羅丹明B與苯乙炔共價加成得到羅丹明B-苯乙烯，再由羅丹明B-苯乙烯與苯乙烯按照1:1～12?的摩爾比聚合，獲得實體熒光納米微球。具體合成路線參見圖1和圖2。

聚苯乙烯是一種無色透明的熱塑性塑料，質地硬而脆，可以和多種染料混合產(chǎn)生不同的顏色。本發(fā)明所采用的熒光分子是羅丹明B，又稱玫瑰紅B、或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，是一種具有鮮艷桃紅色的人工合成的染料，吸收波長在540nm，屬于綠光區(qū)；最大發(fā)射波長在610nm，屬于紅光區(qū)。540nm的激發(fā)光脫離了紫外光區(qū)，能量較小，對生物體不會產(chǎn)生較高的背景熒光，而且與610nm的吸收波長相隔70nm的激發(fā)范圍，一般的生物材料產(chǎn)生的熒光達不到如此高的能量激發(fā)，因此產(chǎn)生的背景熒光更弱。

本發(fā)明將羧基羅丹明B分子和苯乙炔分子進行1:1加成反應，制得羅丹明B-苯乙烯，再將羅丹明B-苯乙烯和苯乙烯進行聚合反應，生成羅丹明B聚苯乙烯，再將羅丹明B聚苯乙烯制成不同粒徑的納米微球。

優(yōu)選地，所述的實體熒光納米微球的制備方法，步驟如下：

（1）羅丹明B的DMSO（二甲基亞砜）溶液與苯乙炔的DMSO溶液混合，混合液中加入CuCl₂的水溶液，混合得反應體系，再加水，在惰性氣體保護下攪拌反應2～4小時；

（2）步驟（1）反應結束后，加入SDS（十二烷基磺酸鈉）、CHPO（過氧化羥基二異丙苯）、TEPA（四乙烯五胺），以及苯乙烯的DMSO溶液，惰性氣體保護下攪拌反應2～4h，獲得聚合物；

（3）聚合物經(jīng)過離心，取沉淀洗滌，干燥，得到實體熒光納米微球。

優(yōu)選地，步驟（1）所述羅丹明B的DMSO溶液中羅丹明B的濃度為0.1～1mol/L；所述苯乙炔的DMSO溶液中苯乙炔的濃度為0.1～1mol/L；所述CuCl₂的水溶液中CuCl₂的濃度為0.05～0.5mol/L。

優(yōu)選地，步驟（1）加水的量與反應體系的體積比為5～30:4。