[發明專利]一種微量多肽化學衍生體系及衍生方法

無效

• 申請號: 201410184193.0
• 申請日: 2014-05-04
• 公開（公告）號: CN103983716A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 紀建國;王青松;安明瑞
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及多肽分析領域，具體涉及一種微量多肽化學衍生體系及該體系的制備方法，還涉及利用該微量多肽化學衍生體系進行多肽正電荷衍生的方法。

背景技術

在質譜(Mass?Spectrometry，MS)技術中，串聯質譜(MS/MS)可用于獲得目標物質結構的碎片，從而對目標物質進行結構分析。目前，通過液相色譜-串聯質譜聯用系統(LC-MS/MS)可以很容易地分離與裂解復雜的多肽混合物，從而進行蛋白質的結構分析。

數據庫檢索法是使用串聯質譜進行蛋白質結構分析時的常規方法。該方法是從特定的蛋白質數據庫中提取目標物質所有的肽段序列，并將它們與串聯質譜所得譜圖進行比較和打分，找到可能性最大的肽段序列。但是，對于基因組未測序的物質，由于無法建立相應的蛋白質數據庫，常規的數據庫檢索方法無法獲得可以與質譜譜圖進行比較分析的多肽序列。

多肽從頭測序技術通過串聯質譜譜圖上碎片離子之間的質量差得到對應的氨基酸殘基，可得到所有物種的肽段序列及翻譯后修飾，無需借助蛋白質數據庫進行檢索和比較即可對多肽序列進行鑒定。多肽從頭測序有著很大的發展潛力，但是目前低可信度的鑒定結果限制了該技術的廣泛應用。這種低可信度主要是由不充分的裂解以及同時產生的N-端系列離子和C-端系列離子相互重疊導致的。

目前，為了避免N-端與C-端系列離子的重疊，提高多肽從頭測序的可信度，可采用多肽N-末端衍生技術進行圖譜簡化處理。該技術包括多肽N-末端的負電荷衍生與正電荷衍生。其中，多肽N-末端正電荷衍生是指在多肽N-末端引入一個季銨基團或季膦基團，從而提高二級譜圖中多肽N-末端碎片離子的信號強度。(琥珀酰亞胺氧基羰基甲基)三(2，4，6-三甲氧苯基)溴化磷(Succinimidyloxycarbonylmethyl?tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphonium?bromide，TMPP-Ac-OSu)是一種重要的多肽N-端正電荷衍生試劑，它可在一個簡單、快速、溫和的條件下對多肽的N-端進行特異性的衍生。

傳統的TMPP-Ac-OSu衍生方法為溶液方法，其缺點是衍生反應產生大量以TMPP-Ac-OH為主的副產物，嚴重影響微量樣品(<1pmol)或者復雜樣品中低豐度多肽的序列分析。

發明內容

本發明的目的是提供一種微量多肽化學衍生體系，并提供該體系的制備方法。

本發明的另一目的是提供利用所述微量多肽化學衍生體系進行正電荷衍生的方法，該方法可有效去除衍生反應副產物，減少多肽衍生物的損失，提高衍生多肽的質譜分析靈敏度。

本發明提供了一種微量多肽化學衍生體系，該體系由置于Eppendorf槍頭中的、由上至下的三層填料層組成，分別為最上層、中間層和最下層。

具體地，

最上層為衍生反應層；其作用為為衍生反應中的肽段與衍生試劑提供固相結合介質。

最上層的厚度為3～5mm。

最上層的填料為反相硅膠填料，填料粒徑為3～10μm。

所述反相硅膠選用C₈或C₁₈，優選為C₈。

中間層為副產物去除層；其作用為去除衍生反應中的鹽離子和反應副產物等雜質；作用原理為陽離子交換原理，即：衍生肽段與填料結合，副產物被洗脫。

中間層的厚度為3～5mm。

中間層的填料為磺酸基陽離子交換鍵合硅膠SCX填料，填料粒徑為3～10μm。

最下層為脫鹽洗脫層；其作用為將衍生反應中的各種鹽去除得到純化的衍生多肽；作用原理為反相色譜洗脫原理，即：衍生肽段與填料結合，鹽被洗脫。

最下層的厚度為3～5mm。

最下層的填料為反相硅膠填料，填料粒徑為3～10μm。

所述反相硅膠選用C₈或C₁₈，優選為C₈。

所述Eppendorf槍頭為實驗室常用Eppendorf槍頭，規格為200μl。

本發明還提供了所述微量多肽化學衍生體系的制備方法。

所述方法包括以下步驟：

1)將一片直徑為1～2mm的特氟龍薄膜水平放置到Eppendorf槍頭底部，以防止填料漏出；

2)將反相硅膠的甲醇懸濁液緩慢加入特氟龍薄膜之上，進行離心，離心機轉速為1000×g，離心時間為5min，最下層即得；