[發(fā)明專利]一種表柔比星誘導建立的乳腺癌多藥耐藥性細胞株及其構(gòu)建方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410183516.4
• 申請日: 2014-05-04
• 公開（公告）號: CN104140953B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設計）人: 李敏;張麗菡;田莉;張春雨
• 申請（專利權(quán)）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11249
• 代理人: 高松

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種表柔比星誘導建立的乳腺癌多藥耐藥性細胞株。

背景技術(shù)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，全球每年乳腺癌的發(fā)病人數(shù)約有120萬人，約50萬人死于乳腺癌。乳腺癌屬全身性疾病，綜合治療非常關(guān)鍵，其中化療是不可替代的重要手段之一。然而多藥耐藥常導致治療失敗及后期腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴重威脅患者生存。腫瘤細胞在化療中產(chǎn)生的耐藥性常表現(xiàn)為多藥耐藥，即同時對多種結(jié)構(gòu)和作用機制不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象，它是化療失敗的主要原因。近年來，腫瘤耐藥細胞株已成為重要的工具，大量研究利用它來揭示腫瘤細胞的耐藥機制、研究腫瘤細胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)、開發(fā)及評價新的抗癌方法等，建立腫瘤耐藥細胞株具有重要應用價值。

蒽環(huán)類（阿霉素、表柔比星）為主的乳腺癌化療方案（CAF/CEF）是目前國際最常用的聯(lián)合化療方案。但是，由于阿霉素對心臟有累積的、濃度依賴性的慢性毒性，其使用及治療劑量常受限制，因此也在一定程度上影響了阿霉素的療效。表柔比星（表阿霉素，Epirubicin）是阿霉素的同分異構(gòu)體，其氨基糖鏈4^，端羥基發(fā)生變形。表柔比星的抗腫瘤效果與阿霉素相當甚至更好，而其細胞毒性和心臟損害都明顯降低，將表柔比星使用較大劑量用于一線治療后，其乳腺癌治療的有效率可達60%以上，高于多柔比星的有效率（24%~38%）。所以目前臨床上大量使用表柔比星代替阿霉素而作為乳腺癌的基礎化療用藥。

表柔比星（表阿霉素，Epirubicin）是蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素中的一種代表性藥物，為阿霉素的同分異構(gòu)體，是一種細胞周期非特異性藥物，對多種轉(zhuǎn)移性腫瘤均有療效。其作用機制有兩個：一、通過嵌入DNA堿基對之間干擾其轉(zhuǎn)錄過程，使mRNA的形成受抑制，從而阻止DNA和RNA的合成。二、對拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（topoisomerase?type?Ⅱ）的活性有抑制作用，從而導致基因組DNA的崩解。

MDA-MB-231細胞是乳腺癌細胞株，是從一名51歲的白人女性乳腺癌患者的胸水中分離建立的，是研究乳腺癌很常用的一種細胞株。國內(nèi)外建立乳腺癌對阿霉素的耐藥細胞株已經(jīng)很常用，而表柔比星的耐藥細胞株仍較少見。本發(fā)明是首次建立MDA-MB-231細胞對表柔比星的耐藥細胞株，建立乳腺癌對表柔比星耐藥細胞株能夠為腫瘤耐藥相關(guān)研究提供必要的研究模型，具有實用價值。

中國專利CN101503675中提出：腫瘤耐藥細胞株的建立通常有兩種方法，一是逐步增加藥物濃度、持續(xù)誘導法，二是大劑量沖擊間斷給藥法。國內(nèi)外均有研究對這兩種方法進行了比較，認為不同誘導方式可能獲得不同耐藥機理的耐藥細胞株，同時也可能影響腫瘤細胞耐藥程度，持續(xù)誘導比沖擊誘導更易產(chǎn)生耐藥性。持續(xù)誘導法以腫瘤細胞最終能在特定濃度化療藥物中穩(wěn)定生長作為誘導成功的判定標準，細胞耐藥性穩(wěn)定、直觀，因此本發(fā)明主要采用該法來誘導耐藥細胞的產(chǎn)生。

腫瘤細胞耐藥程度的判定常用耐藥指數(shù)（resistant?index,?RI)來表示，RI是耐藥細胞半數(shù)抑制濃度（50%?inhibitory?concentration,?IC50)與親代細胞半數(shù)抑制濃度?的比值。Snow等按耐藥指數(shù)的高低將耐藥性分為低度（<?5)、中度(5-15)、高度（>?15)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種表柔比星誘導建立的乳腺癌多藥耐藥性細胞株。

本發(fā)明提供的一種表柔比星誘導建立的乳腺癌多藥耐藥性細胞株：人乳腺癌表柔比星耐藥細胞株MDA-MB-231/EP1，其保藏編號為：CCTCC?C201439。

保藏日期：2014年4月4日；

保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China?Center?for?Type?Culture?Collection)；

保藏單位簡稱：CCTCC；

保藏單位地址：中國武漢市武漢大學；

保藏編號：CCTCC?C201439。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種乳腺癌多藥耐藥性細胞株的構(gòu)建方法：

1.??????將人乳腺癌MDA-MB-231細胞株常規(guī)培養(yǎng)于含有100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃、5%?C0₂、95%濕度培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)；