[發明專利]一種特殊修飾的核苷酸及其在高通量測序方面的應用

有效

• 申請號: 201410182876.2
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103951724B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 戴琳超;朱會英;陸祖宏
• 申請（專利權）人: 南京普東興生物科技有限公司
• 主分類號: C07H19/14
• 分類號: C07H19/14;C07H19/10;C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)32204
• 代理人: 孫承堯

技術領域

本發明屬于生物技術領域，是一種實現核酸序列高通量測定的方法，具體涉及一種特殊修飾的核苷酸及其在高通量測序方面的應用。

背景技術

DNA測序技術是分子生物學研究中最常用的技術，它的出現極大地推動了生物學的發展。成熟的DNA測序技術始于20世紀70年代中期。1977年Maxam和Gilbert報道了通過化學降解測定DNA序列的方法。同一時期，Sanger發明了雙脫氧鏈終止法。20世紀90年代初出現的熒光自動測序技術將DNA測序帶入自動化測序的時代。這些技術統稱為第一代DNA測序技術。最近幾年發展起來的第二代DNA測序技術則使得DNA測序進入了高通量、低成本的時代。高通量測序技術是對傳統測序技術的一次革命性提高，一次能同時對幾百萬甚至幾千萬條DNA序列進行測序，因此也被稱為第二代測序技術或下一代測序技術NGS，同時高通量測序技術也使得對一個物種的整體轉錄組和基因組進行全面的分析成為了可能，所以又被稱為深度測序。目前主流的高通量測序技術主要有三個代表：Roche公司的454測序技術、Illumina公司的Solexa測序技術以及ABI公司的SOLiD測序技術。

三種主流測序平臺都有受限之處，454測序技術最大的優勢在于較長的讀長，然而454測序技術的成本比其它幾種測序技術高出很多，這限制了它的應用。ABI公司的SOLiD測序技術的準確性非常高，但由于采用的是連接法測序，其測序的速度與長度都比其他幾種測序技術要遜色不少。Illumina公司的Solexa測序技術可以說是目前全球公認的通量最高、應用最廣泛的高通量測序技術。Solexa測序技術采用了邊合成邊測序的方法，在合成反應中，加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，采集4色熒光之后，將3’端阻遏基團切除，還原為羥基，隨后進行第二次循環，重復第一個循環的步驟，直到模板序列全部被合成雙鏈DNA。由于3’端阻遏基團的保護而使每次僅延伸一位堿基，增加了測序的時間，并且由于3’端阻遏基團的存在，其對于聚合酶的要求非常之高，這也限制了它的讀長，增加了它的成本。

《兩核苷酸同時合成DNA測序方法》中提出了一種兩核苷酸同時合成的編碼、解碼核酸序列的測定方法及其應用，但由于其核苷酸合成難度較高，不確定性太大，市面上未有成熟的產品。

發明內容

發明目的：針對上述現有技術存在的問題，本發明的目的是提供一種特殊修飾的核苷酸及其在高通量測序方面的應用。本發明也是利用合成測序的原理，使用特殊修飾的核苷酸測序方法實現核酸序列的高通量測序，本發明提供了一種新型的可化學切割的核苷酸，有助于降低測序成本、簡化測序流程并縮短測序時間。

技術方案：為實現上述目的，本發明通過下述技術方案實現：一種特殊修飾的核苷酸，所述核苷酸的化學結構式如下，該核苷酸由Firebird?Biomelecular?Sciences公司合成：

其中，n＝1或2，R表示dATP、dTTP、dCTP、dGTP中任意一種，當n＝1時，得到Cy3-dNTP-diol-NH₂的化學結構式，當n＝2時，得到Cy5-dNTP-diol-NH₂的化學結構式。

上述的核苷酸的熒光標記基團與核苷酸母體是通過含鄰二醇鍵的連接臂連接，并可以通過高碘酸鈉或高錳酸鉀等強氧化劑氧化鄰二醇羥基，使得鄰碳的單鍵斷開，簡單有效地實現化學切割而將熒光標記基團切除出去。

其中，特殊修飾的核苷酸dNTPs-diol-NH2的具體的化學結構式如下：

1、Cy5-dATP-diol-NH2化學結構式：

2、Cy5-dUTP-diol-NH2化學結構式：

3、Cy5-dCTP-diol-NH2化學結構式：

4、Cy5-dGTP-diol-NH2化學結構式：

5、Cy3-dATP-diol-NH2化學結構式

6、Cy3-dUTP-diol-NH2化學結構式

7、Cy3-dCTP-diol-NH2化學結構式

8、Cy3-dGTP-diol-NH2化學結構式

本發明還保護一種特殊修飾的核苷酸在高通量測序方面的應用。