[發明專利]一種特殊修飾的核苷酸及其在高通量測序方面的應用

有效

• 申請號: 201410182876.2
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103951724B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 戴琳超;朱會英;陸祖宏
• 申請（專利權）人: 南京普東興生物科技有限公司
• 主分類號: C07H19/14
• 分類號: C07H19/14;C07H19/10;C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)32204
• 代理人: 孫承堯

1.一種特殊修飾的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的化學結構式如下：

其中，n＝1或2，R表示dATP、dTTP、dCTP、dGTP中任意一種，當n＝1時，得到Cy3-dNTP-diol-NH₂的化學結構式，當n＝2時，得到Cy5-dNTP-diol-NH₂的化學結構式。

2.權利要求1所述的一種特殊修飾的核苷酸在高通量測序方面的應用。

3.一種特殊修飾的核苷酸的高通量測序方法，其特征在于，包括以下步驟：待測核酸序列由權利要求1所述的兩種不同熒光標記的核苷酸Cy3-dNTP-diol-NH₂和Cy5-dNTP-diol-NH₂按照一定的組合分成兩組或兩組以上，對同一待測核酸序列模板進行兩組或兩組以上的測序反應，每組測序反應由上述兩組或兩組以上不同熒光標記的兩種核苷酸循環組成，按照每種核苷酸在一個循環中只使用一次的方式，每進行一次測序反應得到由核苷酸片段構成的一個編碼，測序反應后得到由一組若干編碼構成的核酸序列信息；當該組測序反應完成后，使用變性溶液使雙鏈變性，將測序引物延伸鏈清除，然后重新雜交測序引物，進行后一組的測序反應，得到后一組測序反應排列的若干編碼信息；然后通過解碼兩組或兩組以上的若干編碼信息，組裝出待測核酸片段的具體堿基序列。

4.根據權利要求3所述的一種特殊修飾的核苷酸的高通量測序方法，其特征在于，所述兩種不同熒光標記的核苷酸是指由(Cy3-dUTP-diol-NH₂+Cy5-dCTP-diol-NH₂)、(Cy3-dGTP-diol-NH₂+Cy5-dATP-diol-NH₂)、(Cy5-dUP-diol-NH₂+Cy3-dGTP-diol-NH₂)、(Cy3-dATP-diol-NH₂+Cy5-dCTP-diol-NH₂)、(Cy3-dUTP-diol-NH₂+Cy5-dATP-diol-NH₂)、(Cy3-dCTP-diol-NH₂+Cy5-dGTP-diol-NH₂)六種組合中任一組兩種核苷酸同時進行的合成測序反應。

5.根據權利要求3所述的一種特殊修飾的核苷酸的高通量測序方法，其特征在于，待測核酸序列的解碼是通過解碼兩組或兩組以上按照測序順序排列的若干堿基編碼序列，組裝出待測核酸片段的具體堿基序列信息。

6.根據權利要求3所述的一種特殊修飾的核苷酸的高通量測序方法，其特征在于具體步驟為：

a)測序模板制備：利用超聲波方法將目的基因組打碎成100-500bp的堿基片段，在連接酶的作用下將DNA片段兩端加上一對通用連接子P1、P2；然后凝膠電泳切割180-220bp?DNA片段并純化，并進行8個循環的預擴增得到DNA片段；然后將這些預擴增好的DNA片段與其中一個連接子互補序列的磁珠進行乳液PCR反應，得到大量有目的基因組DNA片段的單克隆磁珠，并變性得到基因組測序模板，最后將這些擴增有目的基因組DNA片段的單克隆磁珠固定在微流控芯片上；

b)測序引物雜交：將單克隆磁珠上的模板鏈與能和3’端連接子互補的引物雜交，雜交引物作為模板DNA的測序引物；

c)測序：將Cy3-dNTPs-diol-NH₂和Cy5-dNTPs-diol-NH₂選擇下述方式的任意兩組或三組進行組合兩核苷解碼循環測序：如1組-1、1組-2、2組-1、2組-2；或1組-1、1組-2、3組-1、3組-2，或1組-1、1組-2、2組-1、2組-2、3組-1、3組-2；

1組-1：Cy3-dUTP-diol-NH₂+Cy5-dCTP-diol-NH₂；

1組-2：Cy3-dGTP-diol-NH₂+Cy5-dATP-diol-NH₂；

2組-1：Cy5-dUTP-diol-NH₂+Cy3-dGTP-diol-NH₂；

2組-2：Cy3-dATP-diol-NH₂+Cy5-dCTP-diol-NH₂；

3組-1：Cy3-dUTP-diol-NH₂+Cy5-dATP-diol-NH₂；

3組-2：Cy5-dGTP-diol-NH₂+Cy3-dCTP-diol-NH₂；

c1)在第一組測序反應中，首先按照Cy3-dUTP-diol-NH₂/dTTP＝50：1、Cy5-dCTP-diol-NH₂/dCTP＝50：1的摩爾比例將四種核苷酸加入，在0.2U/μl9°N?DNA聚合酶的作用下反應5分鐘，然后用含0.01％wt?Trion?X-100、20％wt甘油的緩沖液1洗滌，最后用CCD成相，得到此次測序反應的熒光種類和強度信息的編碼；

c2)用50mM的高碘酸鈉或高猛酸鉀室溫將第一組測序反應中的測序引物、及其測序引物合成鏈處理5分鐘，氧化鄰二醇羥基使得鄰碳的單鍵斷開，清除熒光基團；

c3)按照Cy3-dGTP-diol-NH₂/dGTP＝50：1、Cy5-dATP-diol-NH₂/dATP＝50：1的摩爾比例將四種核苷酸加入，在0.2U/μl9°N?DNA聚合酶作用下反應5分鐘，然后用含0.01％wtTrion?X-100、20％wt甘油的緩沖液1洗滌，最后用CCD成相，得到該次測序反應的熒光種類和強度信息；

c4)用50mM的高碘酸鈉或高猛酸鉀室溫處理5分鐘，氧化鄰二醇羥基，使得鄰碳的單鍵斷開，清除熒光基團；

c5)循環步驟c1)—c4)若干次，直到獲得所需核酸片段相應編碼構成的序列信息；

c6)用含0.005M?NaOH和65％wt甲酰胺的緩沖液2在65℃下處理10分鐘，將第一組測序反應中的測序引物、及其測序引物合成鏈清除，重新得到單鏈DNA模板，然后與測序引物進行雜交反應，然后更換核苷酸的組合，按照上述c1)-c5)的步驟將第二組的核苷酸循環測序，得到第二組核酸片段編碼構成的序列信息；若繼續即可進行第三組的核苷酸循環測序；

d)按照編碼對應核酸片段的方式，分別將每個模板第一、第二組和/或第三組核苷酸循環測序的編碼信息轉化為堿基片段信息；

e)通過比較每個模板第一、第二組和/或第三組的堿基片段信息，并結合測序的順序，將每個模板第一、第二組和/或第三組的堿基片段信息組裝出待測核酸序列的具體堿基信息。

f)將所有模板的堿基序列信息，分別組裝成目標基因組序列。