[發(fā)明專利]一種板栗疫病菌巢式PCR檢測試劑盒及其使用方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410181681.6
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103966325A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱天輝;麻文建;朱涵明月;李姝江;譙天敏;張靜;彭艷;羅蓉
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其涉及的是一種板栗疫病菌巢式PCR檢測試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)

板栗疫病(chestnut blight)是世界著名森林病害之一，也是我國林業(yè)檢疫有害生物之一。其病原為栗疫病菌C.parasitica，主要危害中國板栗(Castanea mollissima)、歐洲板栗(C.sativa Mill.)、錐栗(C.henryi(skan)Rehd.et Wils.)、美洲板栗(Gastanea dentate Marsh.)等山毛櫸科植物。病原主要以傷口侵入方式為主，癥狀主要表現(xiàn)為主干、分枝及小枝上出現(xiàn)爛皮、潰瘍，嚴(yán)重時整個枝條甚至全株枯死。該病于1904年首次在美洲發(fā)現(xiàn)，由于危害嚴(yán)重和蔓延迅速，在其后半個多世紀(jì)中致使歐美栗樹遭到了毀滅性的災(zāi)害。板栗疫病在亞洲也普遍發(fā)生，中國在1913年也發(fā)現(xiàn)了該病，隨后各地陸續(xù)有報道，部分地區(qū)由于病害嚴(yán)重造成林木質(zhì)量和果實(shí)產(chǎn)量嚴(yán)重下降，損失極為嚴(yán)重。板栗疫病在自然發(fā)病的情況下不易被發(fā)現(xiàn)，待其癥狀出現(xiàn)后，再采取防治措施已為時已晚，且現(xiàn)階段對該病尚無有效的根除手段。板栗疫病作為一種檢疫性病害，目前我國對該病的檢疫方法仍是靠病原形態(tài)，病害特征等來判斷，這些方法費(fèi)時且難以識別潛伏期病害。因此，有必要建立快速、準(zhǔn)確和高效率的檢測方法。

PCR技術(shù)的發(fā)展推動了植物病原菌鑒定和病害診斷工作。近年來，利用病原菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列設(shè)計引物進(jìn)行病原菌鑒定、檢測和病害診斷的技術(shù)，使得分子檢測在植物病原檢測這一領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。目前，國內(nèi)對C.parasiticaa分子檢測的工作尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)在檢測板栗疫病菌中存在的不足，提供了一種板栗疫病菌巢式PCR檢測試劑盒及其使用方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種板栗疫病菌巢式PCR檢測試劑盒，其包括(1)10×PCR Buffer，其成份為100mmol·L^-1Tris-HCl，PH8.3，500mmol·L^-1KCl；(2)2.5mmol·L^-1的dNTP；(3)25mmol·L^-1的MgCl2；(4)5U·μL^-1Taq酶；(5)10μmol·L^-1的引物ITS1/ITS4，其中ITS1序列為5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇，ITS4序列為5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇；(6)10μmol·L^-1的引物ITSP1/ITSP2，其中ITSP1序列為5＇-CCAGATACCCTTTGTGAACT-3＇，ITSP2序列為5＇-TCAGAGTCTTAGCGAGCC-3＇；(7)滅菌雙蒸水。

所述的板栗疫病菌巢式PCR檢測試劑盒的使用方法，其步驟如下：

(1)板栗組織DNA提取

采集疑似病害的板栗枝干組織，用刀片切取約100mg小塊組織，表面用70％酒精消毒后蒸餾水沖洗，用吸水紙吸干后，置于研缽中用液氮研磨成粉末，進(jìn)行DNA提取，提取步驟參見TIANGEN公司Plant Genomic DNA Kit試劑盒說明書；

(2)第一輪擴(kuò)增

利用引物ITS1和ITS4對步驟(1)中提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)的混合液體總體積為25μL，其中2.5μL10×PCR Buffer，10μmol·L^-1的引物ITS1/ITS4各0.8μL，2μL2.5mmol·L^-1的dNTP，2μL25mmol·L^-1的MgCl₂，0.2μL5U·μL^-1Taq酶，模板DNA提取液1μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μL；將反應(yīng)混合液于Mastercycler Personal PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min；94℃變性40sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)第二輪擴(kuò)增