[發(fā)明專利]一種板栗疫病菌巢式PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410181681.6
• 申請(qǐng)日: 2014-04-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103966325A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱天輝;麻文建;朱涵明月;李姝江;譙天敏;張靜;彭艷;羅蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種板栗疫病菌巢式PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括(1)10×PCR Buffer，其成份為100mmol·L^-1Tris-HCl，PH8.3，500mmol·L^-1KCl；(2)2.5mmol·L^-1的dNTP；(3)25mmol·L^-1的MgCl₂；(4)5U·μL^-1Taq酶；(5)10μmol·L^-1的引物ITS1/ITS4，其中ITS1序列為5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇，ITS4序列為5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇；(6)10μmol·L^-1的引物ITSP1/ITSP2，其中ITSP1序列為5＇-CCAGATACCCTTTGTGAACT-3＇，ITSP2序列為5＇-TCAGAGTCTTAGCGAGCC-3＇；(7)滅菌雙蒸水。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的板栗疫病菌巢式PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征是，其步驟如下：

(1)板栗組織DNA提取

采集疑似病害的板栗枝干組織，用刀片切取約100mg小塊組織，表面用70％酒精消毒后蒸餾水沖洗，用吸水紙吸干后，置于研缽中用液氮研磨成粉末，進(jìn)行DNA提取，提取步驟參見(jiàn)TIANGEN公司Plant Genomic DNA Kit試劑盒說(shuō)明書；

(2)第一輪擴(kuò)增

利用引物ITS1和ITS4對(duì)步驟(1)中提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)的混合液體總體積為25μL，其中2.5μL10×PCR Buffer，10μmol·L^-1的引物ITS1/ITS4各0.8μL，2μL2.5mmol·L^-1的dNTP，2μL25mmol·L^-1的MgCl₂，0.2μL5U·μL^-1Taq酶，模板DNA提取液1μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μL；將反應(yīng)混合液于Mastercycler Personal PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min；94℃變性40sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)第二輪擴(kuò)增

取(2)中第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍，作為第二輪擴(kuò)增的模板DNA提取液，利用引物ITSP1/ITSP2對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增；其PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)的混合液體總體積為25μL，其中2.5μL10×PCR Buffer，10μmol·L^-1的引物ITSP1/ITSP2各0.8μL，2μL2.5mmol·L^-1的dNTP，2μL25mmol·L^-1的MgCl₂，0.2μL5U·μL^-1Taq酶，模板DNA提取液1μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μL，以滅菌水代替模板DNA設(shè)置陰性對(duì)照；將反應(yīng)混合液于Mastercycler Personal PCR儀，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性40sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR產(chǎn)物于1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外燈或凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶，如果存在462bp的條帶，則判斷所檢測(cè)組織樣品中含有板栗疫病菌，反之則不存在該菌。