[發明專利]一種高油脂含量的四尾柵藻及其構建方法

有效

• 申請號: 201410180811.4
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN103923838A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 劉玉;劉宇峰;姬妍茹;楊慶麗;董艷;石杰
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院大慶分院
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12N15/70;C12R1/89
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務所(普通合伙) 23210
• 代理人: 何強

技術領域

本發明涉及一種高油脂含量的微藻及其構建方法。

背景技術

生物柴油具有能量高、燃燒充分、潤滑性好、含硫量低等優良性能，還具有儲運安全、抗爆性能好、易生物降解等特點，可作為優質的化石能源替代品然而傳統的生物柴油以大豆、玉米、棕櫚樹、麻風樹等農作物為原料，由于原料成本占到生產生物柴油總成本的70％～85％這不僅導致糧食價格上漲也大大增加了生產成本。

我國大慶地區地熱水資源較為豐富，地熱水是從地表滲透或地下抽取上來，可直接地用于溫泉沐浴、采暖、理療等方面。使用后的地熱廢水，大多不經處理而直接排入附近的溝渠之中。大慶地區地熱水中的含鹽量比較高，而且還含有氟、砷、汞等有害的化學成分，尤其是氟，其含量最高達6mg/L左右。地熱廢水若不經過適當處理而隨意排放，廢水中較高含鹽量會造成土壤鹽堿化加重，并且其中的氟及其它有害成分就會因為滲透、遷移、富集作用而造成土壤侵蝕、地下水污染等許多環境問題，甚至進入食物鏈直接危害人體健康。

微藻環境適應能力強、種類繁多、生長周期短、光合效率高，可以利用地熱廢水培養微藻生產生物柴油，即可實現廢水凈化，又能生產生物柴油，可謂是一舉兩得。

四尾柵藻學名Scenedesmus?quadricauda，柵藻科，柵藻屬，是淡水中常見的浮游藻類，分布極廣，極喜在營養豐富的靜水中繁殖，夏秋可大量繁殖，繁殖速度快；對有機污染物具有較強的耐性，是乙型中污帶的指示種，能耐受高氟、砷、汞等有害的化學成分。因此四尾柵藻是利用大慶地區地熱水資源制備生物柴油的合適微藻。但是四尾柵藻本身含油量低，所以導致利用四尾柵藻生產生物柴油的產量一直受到影響。

發明內容

本發明是為了解決現有四尾柵藻含油量低，影響生物柴油產量的問題，而提供的一種高油脂含量的四尾柵藻及其構建方法。

本發明高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGAT1基因，人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

上述高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構建：

一、用質粒pMD19-T載體和人工DGAT1基因構建質粒pMD-DGAT1；

二、提取質粒pMD-DGAT1和質粒pBI121分別用Xba?I和BamH?I進行雙酶切，回收目的基因人工DGAT1基因和載體pBI121，然后連接人工DGAT1基因和載體pBI121，獲得重組質粒pBI121-DGAT1；

三、取培養至對數中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細胞并用預冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置1h，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細胞密度達到10⁸cells/mL；然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42℃熱激10min、冰浴5min并沿管壁加入重組質粒pBI121-DGAT1與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上10min，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續時間為2ms的脈沖電擊；

四、將步驟三電擊轉化的四尾柵藻細胞用微藻培養液清洗兩次，再置于微藻培養液中于22～25℃黑暗環境中培養24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻；

其中，步驟一中人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發明高油脂含量的四尾柵藻的油脂含量達細胞干重的11.8％，是未基因重組的四尾柵藻的油脂含量的近2倍，可顯著提高用四尾柵藻的生物柴油產量，為工業化生物柴油生產奠定了基礎。而且，本發明高油脂含量的四尾柵藻對地熱廢水中的污染物具有良好的耐受性和去除率，特別是是對氟的去除率更是達到了81％。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGAT1基因，人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本實施方式對天然紫蘇的DGAT1基因進行了人為的改造，與天然紫蘇DGAT1基因的同源性為97％。

具體實施方式二：本實施方式高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構建：

一、用質粒pMD19-T載體和人工DGAT1基因構建質粒pMD-DGAT1；