[發明專利]一種高油脂含量的四尾柵藻及其構建方法

有效

• 申請號: 201410180811.4
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN103923838A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 劉玉;劉宇峰;姬妍茹;楊慶麗;董艷;石杰
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院大慶分院
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12N15/70;C12R1/89
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務所(普通合伙) 23210
• 代理人: 何強

1.一種高油脂含量的四尾柵藻，其特征在于高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGAT1基因，人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.權利要求1所述高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構建：

一、用質粒pMD19-T載體和人工DGAT1基因構建質粒pMD-DGAT1；

二、提取質粒pMD-DGAT1和質粒pBI121分別用Xba?I和BamH?I進行雙酶切，回收目的基因人工DGAT1基因和載體pBI121，然后連接人工DGAT1基因和載體pBI121，獲得重組質粒pBI121-DGAT1；

三、取培養至對數中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細胞并用預冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置1h，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細胞密度達到10⁸cells/mL；然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42℃熱激10min、冰浴5min并沿管壁加入重組質粒pBI121-DGAT1與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上10min，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續時間為2ms的脈沖電擊；

四、將步驟三電擊轉化的四尾柵藻細胞用微藻培養液清洗兩次，再置于微藻培養液中于22～25℃黑暗環境中培養24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻；

其中，步驟一中人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

3.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟二用獲得的重組質粒pBI121-DGAT1轉化感受態細胞大腸桿菌DH5α，然后進行藍白斑篩選，挑選白色菌落進行PCR驗證和酶切驗證。

4.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟三中滲透液中甘油的體積濃度為10％、甘露醇的濃度為0.2mol/L、山梨醇的濃度為0.2mol/L。

5.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟三中鮭精DNA的終濃度為25μg/mL。

6.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟四中微藻培養液為BG11液體培養基。

7.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟四中將獲得的高油脂含量的四尾柵藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BG11固體培養基平板上，未加重組質粒的四尾柵藻同樣處理作為對照；15天后挑取在卡那霉素固體培養基平板上長出的轉化子四尾柵藻群落轉接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液體培養基中，繼續培養15天后轉接到沒有抗生素的固體培養基上，隔代在抗生素與無抗生素的培養基中進行交替培養，獲得性狀穩定的高油脂含量的四尾柵藻。