[發明專利]己烯雌酚一步式化學發光酶免疫分析檢測法及試劑盒

有效

• 申請號: 201410180431.0
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN103954780A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 吳健敏;馬玲;張啟模;韋建興;張怡軒;白安斌;陳鳳蓮;覃紹敏;林俊;劉金鳳;饒桂波
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N21/76;C07K16/44
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種己烯雌酚一步式化學發光酶免疫分析檢測法，其特征在于包括以下步驟：

<1>處理待測樣品；

<2>將半抗原己烯雌酚與載體蛋白卵清蛋白的偶聯物DES-OVA作為抗原包被于發光固相載體，封閉后，依次加入系列標準樣品或經前處理的待測樣品、酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和己烯雌酚單克隆抗體DES-McAb進行反應，然后再加入化學發光液，測定系列標準樣品和待測樣品的發光值；

<3>以步驟<2>測得的發光值計算抑制率，繪制標準曲線，并根據標準曲線的回歸方程和待測樣品的抑制率計算待測樣品中己烯雌酚的含量。

2.根據權利要求1所述的己烯雌酚一步式化學發光酶免疫分析檢測法，其特征在于：

步驟<1>按以下操作進行：取5g組織樣品加入10mL叔丁基甲基醚，劇烈震蕩5min后，超聲提取10min，3000g/min離心10min，移出上清液后，用10mL叔丁基甲基醚重復提取沉淀物，將兩次的上清液合并，吹干，用1mL甲醇溶液溶解，再用3mL石油醚洗滌甲醇溶液；蒸發甲醇，用1mL二氯甲烷溶解后，再用3mL1N?NaOH溶液提取，最后，用300μL磷酸中和提取液，用于檢測；

步驟<2>按以下操作進行：用包被液將抗原稀釋成0.5μg/mL，每孔加入100μL，4℃孵育過夜，傾去包被液，用洗板機洗滌化學發光板3次，拍干；然后，每孔加入350μL封閉液，37℃孵育2h，傾去封閉液，用洗板機洗滌3次，拍干；37℃烘干后，用錫箔紙真空密封，4℃保存；將化學發光板從4℃中取出，待溫度平衡至室溫，按照每孔50μL將系列標準樣品溶液和待測樣品加入化學發光板，各設3孔重復，然后依次加入各50μL酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、DES-McAb，混勻，37℃孵育45min；傾去液體，用洗板機洗滌5次，拍干；每孔中加入100μL化學發光液，混勻，盡快測定各孔發光值。

3.根據權利要求2所述的己烯雌酚一步式化學發光酶免疫分析檢測法，其特征在于：所述封閉液是5％的脫脂奶粉；所述DES-McAb稀釋為0.2μg/mL；所述系列標準樣品溶液的濃度為0μg/L、0.001μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L；所述包被液是pH9.6的碳酸鹽緩沖液。

4.一種己烯雌酚一步式化學發光酶免疫分析檢測試劑盒，其特征在于包括包被有DES-OVA的化學發光板、DES系列標準樣品溶液、DES-McAb工作液、濃縮洗滌液、酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化學發光液；所述包被抗原DES-OVA為DES與載體蛋白卵清蛋白的偶聯物；所述DES系列標準樣品溶液為7個濃度梯度，分別是0μg/L、0.001μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L；所述濃縮洗滌液由NaCl8.00g、KH₂PO₄0.20g、Na₂HPO₄·12H₂O2.90g、KCl0.20g、吐溫-200.50mL，加水定容至100mL制成；所述化學發光液來自超敏ECL化學發光試劑盒P0018—BeyoECL?Plus。

5.權利要求4所述試劑盒在動物源性食品中己烯雌酚殘留檢測中的應用。

6.一種己烯雌酚單克隆抗體，其特征在于按以下操作制備：以己烯雌酚與載體蛋白牛血清白蛋白的偶聯物DES-BSA作為免疫原，免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，按照常規方法進行細胞融合和陽性株的篩選，對篩選出的陽性細胞株連續克隆3次，經過鑒定、凍存和建株后，進行腹水的制備，然后通過純化腹水，獲得能特異性識別己烯雌酚的單克隆抗體。

7.根據權利要求6所述的己烯雌酚單克隆抗體，其特征在于按以下操作制備：：

<1>動物免疫

將健康的6周齡雌性BALB/c小鼠通過基礎免疫和5次加強免疫后，對效價最高、競爭性最強的小鼠進行沖擊免疫；

<2>細胞融合和克隆篩選

沖擊免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后處死，收集血液、無菌取脾臟，融合小鼠免疫脾細胞與Sp2/0細胞，融合后的細胞懸液加至已鋪有飼養細胞的96孔板中，采用HAT選擇培養基篩選融合細胞；

待細胞生長至培養孔面積1/10時，無菌準確吸取100μL上清，加至已包被抗原DES-OVA的酶標板內；以間接ELISA法測細胞培養上清效價，采用有限稀釋法對陽性細胞連續克隆3次，直至陽性率為100％時，對細胞株進行擴大培養、鑒定、凍存和建株，對鑒定后細胞株進行連續培養傳代2個月以上，每隔5代檢測其穩定性和抗體分泌能力；

<3>細胞凍存與復蘇

用凍存液將處于對數生長期的雜交瘤細胞制成細胞懸液，分裝于凍存管，置于液氮中保存；復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液，移入細胞瓶中培養；

<4>腹水的制備與純化

采用體內誘生法，將滅菌石蠟油注入8周齡Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入雜交瘤細胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用飽和硫酸銨法進行初純后，再用親和層析法進一步純化，即得DES-McAb。