[發明專利]己烯雌酚一步式化學發光酶免疫分析檢測法及試劑盒

有效

• 申請號: 201410180431.0
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN103954780A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 吳健敏;馬玲;張啟模;韋建興;張怡軒;白安斌;陳鳳蓮;覃紹敏;林俊;劉金鳳;饒桂波
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N21/76;C07K16/44
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于己烯雌酚檢測分析領域，尤其涉及一種己烯雌酚一步式化學發光酶免疫分析檢測法及試劑盒。

背景技術

己烯雌酚(Diethylstilbesrtol，DES)是一種人工合成的雌激素，在促進子宮、輸卵管、乳腺的生長發育和蛋白質合成、減少脂肪、提高日增重等方面效果顯著，因而曾作為促生長劑用于畜禽、水產生產中。然而，許多科學研究表明DES能通過改變內分泌系統引發人和動物的癌癥，還可以經胎盤致癌，即妊娠期使用，可導致胎兒生殖器官的畸變，甚至癌變。另外，DES很難降解，如排出體外，會嚴重污染水源和土壤，并通過食物鏈威脅人類健康和生態環境，形成惡性循環。因此，我國在1999年制定《中國人民共和國動物及動物源食品殘留監測計劃》中規定在動物源性食品衛生中不得檢出DES，2002年又將其列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》(農業部公告193號)。然而，由于巨大利益的驅使，違法添加DES的情況仍屢禁不絕，嚴重威脅著人類健康。

目前，文獻報道的DES檢測方法主要有色譜法(氣相色譜、氣相色譜-質譜聯用、高效液相色譜等)、免疫法(放射免疫法、酶聯免疫吸附法、化學發光酶免疫分析法)以及熒光分光光度計法、輻照分光光度法、生物分析法等。由于DES在體內代謝快，組織濃度較低，所以其檢測方法應更靈敏、準確。化學發光酶免疫分析法(Chemiluminescence?enzyme?immunoassay，CLEIA)以其靈敏度高、特異性好、操作簡便、無輻射、標記物有效期長等優點，越來越多地用于臨床樣品的高通量篩選，是一項十分有發展前景的分析監測技術，近年來已被應用于多種藥物殘留的檢測。目前我國DES檢測試劑盒主要是ELISA檢測試劑盒，而且幾乎完全進口，如英國RANDOX、德國r-Biopharm等，因此，建立檢測DES的化學發光酶免疫分析法及其試劑盒有較好的實際意義。

中國專利“一種檢測己烯雌酚的方法及其專用化學發光免疫試劑盒”(專利號201010244284.0公開日2011年1月5日)采用兩步式化學發光酶聯免疫檢測體系，操作步驟繁多且復雜。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏、準確、檢測范圍寬的己烯雌酚一步式化學發光酶免疫分析檢測法及試劑盒。

本發明要解決的另一技術問題是提供一種特異性高、親和力強的己烯雌酚單克隆抗體。

為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

己烯雌酚一步式化學發光酶免疫分析檢測法，包括以下步驟：

<1>處理待測樣品；

<2>將半抗原己烯雌酚與載體蛋白卵清蛋白的偶聯物(DES-OVA)作為抗原包被于發光固相載體，封閉后，依次加入系列標準樣品或經前處理的待測樣品、酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和己烯雌酚單克隆抗體(DES-McAb)進行反應，然后再加入化學發光液，測定系列標準樣品和待測樣品的發光值；

<3>以步驟<2>測得的發光值計算抑制率，繪制標準曲線，并根據標準曲線的回歸方程和待測樣品的抑制率計算待測樣品中己烯雌酚的含量。

步驟<1>按以下操作進行：取5g組織樣品加入10mL叔丁基甲基醚，劇烈震蕩5min后，超聲提取10min，3000g/min離心10min，移出上清液后，用10mL叔丁基甲基醚重復提取沉淀物，將兩次的上清液合并，吹干，用1mL甲醇溶液溶解，再用3mL石油醚洗滌甲醇溶液；蒸發甲醇，用1mL二氯甲烷溶解后，再用3mL1N?NaOH溶液提取，最后，用300μL磷酸中和提取液，用于檢測；

步驟<2>按以下操作進行：用包被液將抗原稀釋成0.5μg/mL，每孔加入100μL，4℃孵育過夜，傾去包被液，用洗板機洗滌化學發光板3次，拍干；然后，每孔加入350μL封閉液，37℃孵育2h，傾去封閉液，用洗板機洗滌3次，拍干；37℃烘干后，用錫箔紙真空密封，4℃保存；將化學發光板從4℃中取出，待溫度平衡至室溫，按照每孔50μL將系列標準樣品溶液和待測樣品加入化學發光板，各設3孔重復，然后依次加入各50μL酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、DES-McAb，混勻，37℃孵育45min；傾去液體，用洗板機洗滌5次，拍干；每孔中加入100μL化學發光液，混勻，盡快測定各孔發光值。